核轉(zhuǎn)錄因子-κB、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-3在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)研究

馬軍偉，王 佳，宋 煒，白 潔

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西 延安 716000)

乳腺腫瘤發(fā)病率高，每年新增患者167.1萬，死亡率高，每年約有52.2萬患者死亡[1，2]。我國乳腺腫瘤發(fā)病人數(shù)約占全球發(fā)病人數(shù)的12.2%，死亡率居惡性腫瘤第六位，且呈逐年上升趨勢[3，4]。是否轉(zhuǎn)移是評估乳腺腫瘤患者預(yù)后的重要影響指標(biāo)，NF-κB、ERK1/2、MTA-3在乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用[5，6]，但NF-κB、ERK1/2、MTA-3在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲中的作用機(jī)制尚不十分明確[7，8]。為探討核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-3(MTA-3)在乳腺腫瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制，本研究對60例乳腺腫瘤患者和30例同期乳腺增生患者的組織樣本進(jìn)行了檢測分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院2017年8月至2019年3月收治的60例行切除手術(shù)的乳腺腫瘤(浸潤性導(dǎo)管癌)患者作為觀察組，年齡21～67歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②臨床相關(guān)資料完整；③均為原發(fā)灶；④浸潤性導(dǎo)管癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②術(shù)前行放化療和內(nèi)分泌治療或其他抗癌治療者；③存在家族病史者。另取30例同期乳腺增生患者作為對照組，年齡25～62歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為良性病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往存在癌癥史者。②均未采取放化療及內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署研究知情同意書。兩組年齡、性別等基礎(chǔ)資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性(P<0.05)。

1.2 方法將組織樣本切片，脫蠟入水，使用微波輻射進(jìn)行抗原修復(fù)，然后在3%過氧化氫去離子水中孵育10 min，再血清封閉15 min。加一抗于4 ℃孵育箱中過夜，然后再加二抗于37 ℃孵育箱中孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液后再于37 ℃孵育箱中孵育15 min，以二胺基聯(lián)苯胺染色5 min，然后以核固紅進(jìn)行輕度復(fù)染，用蒸餾水清洗干燥后以水溶性封片劑封片，于常溫下保存。在光學(xué)顯微鏡下選擇細(xì)胞數(shù)目較恒定區(qū)域，觀察NF-κB、ERK1/2、MTA-3陽性細(xì)胞數(shù)并拍片。其中，NF-κB陽性表達(dá)為胞漿、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1B)，ERK1/2陽性表達(dá)為胞漿、胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒(圖1C)，MTA-3陽性表達(dá)為胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒(圖1D)。免疫組化染色判斷標(biāo)準(zhǔn) “-”：無陽性表達(dá)；“+”：陽性細(xì)胞百分率為1%～30%；“++”：陽性細(xì)胞百分率為31%～70%；“+++”：陽性細(xì)胞百分率為71%～100%[11]。檢測試劑為NF-κB和ERK1/2鼠抗人單克隆抗體(Neo Marker 公司)，以及MTA-3濃縮型兔抗人多克隆抗體(Abcam 公司)，檢測按通用二步法試劑盒及二胺基聯(lián)苯胺染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)及說明書操作。

圖1 乳腺癌病理組織標(biāo)本免疫組化檢測結(jié)果 a：對照組；b：NF-κB陽性表達(dá)；c：ERK1/2陽性表達(dá)；d：MTA-3陽性表達(dá) (SP法，×100)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組陽性檢出率比較觀察組NF-κB、ERK1/2、陽性檢出率高于對照組；MTA-3陽性檢出率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組陽性檢出率比較 [n(%)]

2.2 不同臨床特征的乳腺癌患者三種因子陽性率比較臨床分期越高者、腫瘤直徑越大者，NF-κB、ERK1/2陽性檢出率越高，MTA-3陽性檢出率低越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LuminalA型、LuminalB型及HER2陽性分子分型患者NF-κB、ERK1/2陽性檢出率高于三陰型，MTA-3陽性檢出率低于三陰型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征的乳腺癌組織中NF-κB、ERK1/2、MTA-3陽性檢出率的關(guān)系 [n(%)]

2.3 乳腺增生患者與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者陽性檢出率比較對照組NF-κB、ERK1/2、陽性檢出率低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；MTA-3陽性檢出率高于無轉(zhuǎn)移患者及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 乳腺增生患者與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者陽性檢出率比較 [n(%)]

3 討論

惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征之一是轉(zhuǎn)移，能否降低臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的漏診率和誤診率對提高患者預(yù)后具有重要意義[9，10]。腫瘤細(xì)胞遷移受到多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路調(diào)控及多種蛋白和酶的控制，包括PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等信號通路，MEK、ERK1/2或MEK/ERK1/2等細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，以及MTA-1、MTA-2和MTA-3等轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白[11，12]。目前對NF-κB、ERK1/2、MTA-3在乳腺腫瘤組織中的相關(guān)作用機(jī)制表達(dá)并不十分明確。

本研究結(jié)果顯示乳腺癌患者組NF-κB陽性檢出率高于乳腺增生組，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中NF-κB陽性檢出率也顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，且與轉(zhuǎn)移部位沒有顯著相關(guān)。NF-κB對多種腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因或細(xì)胞因子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，包括基質(zhì)金屬蛋白酶和白介素-8等，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶直接與乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移擴(kuò)散有關(guān)[13]。根據(jù)Penzo等[14]的研究，趨化因子CXCL12對細(xì)胞的定向誘導(dǎo)遷移作用和淋巴組織(淋巴結(jié)和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞)的基礎(chǔ)歸巢作用均依賴于NF-κB信號傳導(dǎo)通路。NF-κB是Rel家族中五種亞單位組成的二聚體，其存在的最常見形式為p50和p65組成的異二聚體，在靜息狀態(tài)下，IκBα與NF-κB/p65以非活性復(fù)合物的形式存在細(xì)胞質(zhì)中，一旦NF-κB被激活，就會從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而對基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用[15]。也有研究表明[16]，蒽醌類衍生物可以降低IκBα的磷酸化和泛素化，從而抑制和阻斷了NF-κB/p65信號通路。

本研究結(jié)果還顯示在乳腺腫瘤組患者中ERK1/2陽性檢出率(96.67%)顯著高于乳腺增生組(3.33%)，這是因?yàn)镸EK/ERK1/2細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)中，PDZK1為主要調(diào)控基因，其作用機(jī)制與NF-κB較為相似，有研究[17，18]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)PDZK1基因與乳腺腫瘤相關(guān)，并在ER陽性乳腺腫瘤患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，參與了乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個信號通路調(diào)節(jié)，說明PDZK1調(diào)控乳腺癌的ERK1/2調(diào)節(jié)作用，與本研究結(jié)果一致。對于三陰型乳腺腫瘤而言，相較于其他分子分型的乳腺腫瘤，其漏診率、誤診率更高，干預(yù)策略更少，預(yù)后更差。從本研究的分子分型相關(guān)性結(jié)果來看，三陰型和HER2陽性分型患者相較Luminal型存在顯著高ERK1/2陽性檢出率(P<0.05)，這可能與HERERK1/2信號通路與三陰型乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的表達(dá)有關(guān)，ERK1/2與MDA-MB-231細(xì)胞合成直接導(dǎo)致ERK1/2磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，從而導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移。侯俊杰等[20]研究證實(shí)，二甲雙胍可以通過對MDA-MB-231細(xì)胞P-ERK1/2蛋白合成具有直接抑制作用，可以通過阻斷MEK/IGF1/P-ERK/S6信號通路，來降低ERK1/2磷酸化表達(dá)水平來達(dá)到對三陰乳腺癌的抑制作用，說明ERK1/2在三陰乳腺癌分型的乳腺腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中具有一定的作用，從本研究的數(shù)據(jù)也得到了體現(xiàn)，ERK1/2在三陰型乳腺腫瘤組織中陽性檢出率為100%，充分顯示了ERK1/2信號通路在三陰型乳腺腫瘤微環(huán)境通信中的關(guān)鍵性作用，也對三陰乳腺癌的診斷和治療干預(yù)提供一定的數(shù)據(jù)支持。本研究結(jié)果顯示乳腺腫瘤組的MTA-3陽性檢出率顯著低于乳腺增生組，MTA-3在三陰乳腺癌分型呈現(xiàn)較低的陽性檢出率(P<0.05)，也說明三陰乳腺癌分型的預(yù)后較其他三種分子分型更差。MTA-3是Mi-2核小體重組蛋白與脫乙酰酶蛋白復(fù)合體的重要組成部分，其雖然與MTA-1、MTA-2同源，但功能差異巨大[21]，MTA-3表達(dá)陽性則表示乳腺腫瘤患者預(yù)后良好的保護(hù)因素[22]。MTA-3在乳腺腫瘤患者中高表達(dá)，隨有轉(zhuǎn)移、腫瘤越大、臨床分級越高而有增高的趨勢。Si等[23]通過小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MTA-3具有抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。也有研究認(rèn)為[24]，MTA-3與乳腺腫瘤分子分型生物學(xué)指標(biāo)Ki-67呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果提示MTA-3參與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是與下調(diào)Ki-67表達(dá)水平、上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平有關(guān)。進(jìn)一步探討乳腺癌的MTA-3表達(dá)水平的變化和調(diào)節(jié)機(jī)制有助于深入了解乳腺癌和三陰乳腺癌分型的疾病機(jī)制。

綜上，在乳腺腫瘤組織中存在NF-κB和ERK1/2的高陽性表達(dá)和MTA-3和低表達(dá)，NF-κB廣泛參與調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，ERK1/2在乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程中扮演調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路的作用，MTA-3與乳腺腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此在臨床實(shí)踐中結(jié)合三者指標(biāo)分析可以提高乳腺腫瘤患者的診斷和干預(yù)率，改善乳腺腫瘤患者的預(yù)后。