用于3種農(nóng)藥殘留快速檢測的熒光免疫芯片研發(fā)及其應(yīng)用

崔海峰，賈芳芳，陳立軍，武妹霞，惠光朋，何方洋*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京；3.河北省灤州市農(nóng)業(yè)村局，河北 灤州）

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥使用品種多、用量大，可以有效保障或提高農(nóng)作物產(chǎn)量[1]，但長期大規(guī)模不合理使用，會造成食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留，損害消費(fèi)者的身體健康；另一方面，農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，還會不可避免地殘留在飼料當(dāng)中，致使其進(jìn)入動物體內(nèi)，降低動物的生長性能，嚴(yán)重者可危害動物健康甚至導(dǎo)致動物死亡，且殘留在動物產(chǎn)品中的農(nóng)藥也可能危害人類健康[2]。目前針對農(nóng)藥殘留及其代謝物的檢測主要是依靠色譜法、質(zhì)譜法等儀器分析手段[3-6]，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)定性與定量分析，但檢測費(fèi)用高、周期長，且需要專門的操作人員，不適用于對大量樣品進(jìn)行低成本快速篩選。而免疫分析技術(shù)因其操作簡單、快速、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為最具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ姆治黾夹g(shù)之一[7]。

常見的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫層析技術(shù)。趙妍等[8]建立了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法，對 8種擬除蟲菊酯具有較高的靈敏度，IC50范圍在8.69 ～ 344.97 ng/ml；LAN 等[9]基于廣譜特異性單克隆抗體，建立了同時(shí)檢測蔬菜水果中克百威及其代謝物 3-羥基克百威的 ELSIA方法；周嘉明等[10]建立了基于膠體金免疫層析法的三氯殺螨醇快速檢測試紙條的研制方法，其對茶葉中三氯殺螨醇檢測限為0.2 mg/kg，檢測時(shí)間8 min；Sheng等[11]建立了乙氧氟草醚直接和間接競爭時(shí)間分辨熒光免疫分析法，IC50分別為 10.27 ng/ml和2.76 ng/ml。以上建立的用于農(nóng)藥殘留檢測ELISA方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，但仍需較為繁瑣的操作步驟，檢測速度相對較慢，不能完全滿足農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速篩查的要求。相對而言，免疫層析技術(shù)檢測速度快、操作簡單，而且熒光層析法的靈敏度和準(zhǔn)確性較膠體金法更勝一籌[12]。因此，本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合，研制了 3種農(nóng)藥多殘留快速檢測免疫芯片，以滿足農(nóng)藥多殘留現(xiàn)場快速篩查的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測材料 胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料，購自于北京某超市。

1.1.2 儀器 克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物、克百威單克隆抗體，毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物、毒死蜱單克隆抗體，滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物、滅蠅胺單克隆抗體，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制；克百威標(biāo)準(zhǔn)品、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98.0 %，美國Sigma公司；FT04C時(shí)間分辨熒光微球（表面連接有-COOH基團(tuán)，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長 615 nm），蘇州為度生物技術(shù)有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物（MES）、雞 IgY、羊抗雞IgY，美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（NC膜），德國 Sartorius公司；樣品墊、吸水墊、PVC底板，上海捷寧生物科技有限公司。LGJ-50C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；XYZ3050膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng)，美國 BIODOT公司；AQ4200數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；KQ2200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；M8多功能振蕩混合器，上海邁皋科學(xué)儀器有限公司；芯片分析儀，北京勤邦生物技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；低速離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 活化緩沖液：0.05 mol/L MES，pH6.0。偶聯(lián)緩沖液：0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液（BB），pH 8.0。洗滌緩沖液：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（PB），pH 7.4。封閉緩沖液：含0.04 mol/L鹽酸羥胺及 1 % 酪蛋白的中性 PB。貯存緩沖液：含0.05 % Proclin 300及0.1 % 酪蛋白的中性PB。樣本提取液：0.02 mol/L PB + 5 %甲醇。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）熒光微球標(biāo)記抗體的制備：①活化：取 50 μl 300 nm粒徑的熒光微球懸液，用活化緩沖液 MES 10倍稀釋后，等量分裝于棕色避光離心管中，渦旋混勻，12 000 r/min、4 ℃ 離心15 min，棄上清；同法用MES洗滌1次，離心棄上清。稱取EDC和NHS各10 mg，分別用1 ml MES溶解后，取 5 μl EDC溶液及 20 μl NHS溶液加入離心管中，補(bǔ)加 MES重懸至離心前體積，200次/min振蕩，室溫反應(yīng) 15 min。②偶聯(lián)：活化處理后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄上清；用BB洗滌1次，離心棄上清。取克百威、毒死蜱、滅蠅胺單克隆抗體（檢測用）及雞IgY（質(zhì)控用），使用超微量紫外分光光度計(jì)測定濃度后，分別以 0.2～0.8 mg/ml的添加量加入各離心管中，以 BB作為稀釋液，重懸各份熒光微球至離心前體積，200次/min震蕩，室溫反應(yīng) 4 h。③封閉：偶聯(lián)結(jié)束后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min，棄上清；用封閉緩沖液重懸至離心前體積，200次/min振蕩，室溫反應(yīng) 1 h。④貯存：封閉結(jié)束后的微球偶聯(lián)物懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min，棄上清；用 PB洗滌 1次，離心棄上清。洗滌后的微球偶聯(lián)物用貯存緩沖液洗滌 2次，重懸至離心前體積，4 ℃ 避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）檢測試劑的制備：按適當(dāng)比例稀釋、混勻檢測微球與質(zhì)控微球的偶聯(lián)物懸液，即制成熒光微球檢測試劑。平底管中添加 100 μl稀釋懸液，-50 ℃ 預(yù)凍 3 h，真空干燥 15 h，取出后加蓋、加干燥劑密封，置4 ℃ 避光保存。

（3）熒光免疫芯片的制備：如圖 1所示，將一定濃度的克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測線，T1）、毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測線，T2）、滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測線，T3）和羊抗雞 IgY（質(zhì)控線，C線）分別點(diǎn)陣包被在 NC膜上，并根據(jù)層析方向由下至上，將樣品墊、NC膜、吸水墊依次粘貼于 PVC底板上，將組裝好的板條切割成寬為 8 mm的試紙條，加干燥劑封裝備用。

圖1 熒光免疫芯片結(jié)構(gòu)圖

（4）樣品處理與檢測：取新鮮樣品擦去泥土，剪碎成小于 1 cm 見方的碎片，稱取 2.00±0.05 g樣品至 10 ml聚苯乙烯離心管中，加入4 ml樣本提取液，振蕩 30 s，靜置 1 min，吸取400 μl上層液體加入制備的檢測試劑中，連續(xù)吹打 5次混勻，靜置 3 min，即為樣品待檢液。將制備的熒光免疫芯片插入檢測試劑中，室溫反應(yīng)5 min，用芯片分析儀讀取 T、C線的熒光強(qiáng)度，計(jì)算 T/C值，T/C≥1，判為陰性（-）；T/C＜1，判為陽性（+）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測限

在空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品中分別添加克百威、毒死蜱、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品至表1所列的濃度，用免疫芯片進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù) 3次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測限。由表1結(jié)果可知，當(dāng)樣品中克百威、毒死蜱、滅蠅胺濃度分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg時(shí)，各農(nóng)藥對應(yīng)的檢測結(jié)果為陽性，因此確定該熒光免疫芯片的檢測限為：克百威 0.02 mg/kg、毒死蜱0.5 mg/kg、滅蠅胺0.5 mg/kg。

表1 檢測限實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2 特異性

取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨各 1份，在其中分別添加其他常見的 10種農(nóng)藥至濃度為 10 mg/kg，用免疫芯片進(jìn)行檢測，每種藥物重復(fù)3次，判定芯片的特異性。由表2可知，樣本中常見的其他農(nóng)藥對 3個(gè)點(diǎn)陣條帶均不產(chǎn)生干擾，結(jié)果都顯示陰性，說明本芯片對 3種藥物特異性較好。

表2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3 準(zhǔn)確性

取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品各10份，分別添加3種農(nóng)藥至2.1確定的檢測限濃度，用免疫芯片進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù) 3次，計(jì)算假陽性率和假陰性率，結(jié)果見表 3。由結(jié)果可知，對陰性樣本、陽性樣本進(jìn)行檢測，無假陽性、假陰性出現(xiàn)，結(jié)果判定準(zhǔn)確，說明本免疫芯片可以對果蔬樣本中的克百威、毒死蜱、滅蠅胺3種農(nóng)藥同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析。

表3 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 關(guān)于動物飼料方面檢測的適用性

由于市場需求，本研究暫時(shí)只測定了胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本，后續(xù)研究還會增加樣本進(jìn)行測定。本研究制備的農(nóng)藥殘留快速檢測熒光免疫芯片，只需要根據(jù)樣本特點(diǎn)調(diào)整其前處理方法，即能夠檢測出該樣本的農(nóng)藥殘留量，因此，本芯片對于其他動物飼料方面的檢測，同樣適用。

3 結(jié)論

時(shí)間分辨免疫熒光是20世紀(jì)80年代在傳統(tǒng)免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，使用具有獨(dú)特?zé)晒馓卣鞯蔫|系元素及其螯合物，靈敏度高、特異性好、無放射元素污染[13]；生物芯片技術(shù)是采用微量點(diǎn)樣等方法，將生物大分子有序地固化在載體表面組成密集的點(diǎn)陣列，具有高通量、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)[14]。本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合，以硝酸纖維素膜為載體，農(nóng)藥抗原為捕獲探針，制作了一種包含 3種抗原抗體組合的免疫芯片，可同時(shí)檢測甲克百威、毒死蜱、滅蠅胺，檢測限分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg，假陰性率、假陽性率均為 0，準(zhǔn)確度較高；對常見的其他 10種農(nóng)藥無交叉反應(yīng)，特異性較好；檢測速度快，從制樣到得出結(jié)果僅需15 min。本方法將傳統(tǒng)試紙條的劃線模式改成點(diǎn)陣形式，可以有效避免劃線引起的多項(xiàng)目之間的顯色干擾。該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中多種農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場篩查和檢測，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。