舒芬太尼對大鼠蛛網膜下腔出血后腦損傷的保護作用

周有東 馬金陽 黃 松 胡火軍 符常濤 袁 高 郭金滿 汪 雷

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是多種因素引起的腦卒中的一個亞型，主要原因是顱內動脈瘤破裂，病死率高[1]。SAH后腦損傷指SAH后發生的一系列病理生理過程，包括顱內壓增高、腦血流量和腦灌注壓降低、血腦屏障受損、急性血管痙攣、腦水腫、神經炎癥及神經元凋亡等[2]。研究發現活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累和氧化應激反應與SAH后腦損傷和繼發性缺血性神經功能障礙密切相關[3]。臨床研究發現，SAH后抗氧化相關酶減少，脂質過氧化物增加，與不良預后密切相關[4]。有研究應用舒芬太尼治療腦出血[5]。本研究探討舒芬太尼對大鼠SAH后腦損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組60只健康成年雄性SD大鼠，7～8周齡，體重250～500 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號[SCXK（魯）2019-0003]。該研究經本院動物醫學委員會批準，符合中國實驗動物制度科學研究審查委員會關于動物實驗的指導指南。60只大鼠隨機分為假手術組、模型組和舒芬太尼組，每組20只。

1.2 動物模型建立及干預 參考文獻[6]報道的方法制作SAH模型。SD大鼠適應性喂養2周后，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，結扎右側頸外動脈和頸內動脈，剪斷頸外動脈。4-0尼龍縫合線沿頸外動脈引入頸內動脈，直到感覺阻力（約18 mm），然后將縫合線再推進約1 mm穿透動脈，迅速撤出縫合線，結扎頸外動脈，縫合切口。假手術組僅將縫合線引入頸動脈分叉處感覺阻力時，拔出縫合線，不穿透動脈。舒芬太尼組造模后6 h，尾靜脈注射舒芬太尼溶液，5μg/kg，1次/d，連續3周；假手術組和模型組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3 神經功能評估 造模后1、2、21 d參考文獻[7]報道的方法，采用改良神經嚴重性量表（modified neurological severity scale，mNSS）評分評估神經功能。評分范圍0～18分，其中完全正常、無神經功能缺損評分為0分，意識喪失或死亡評分為18分。

1.4 腦水腫測定 末次神經功能評估結束后，每組取5只大鼠采用干濕重比法測定腦組織含水量。大鼠深度麻醉后，斷頭處死，迅速分離損傷灶半球腦組織，用濾紙吸干表面水分，稱其重量為濕重；然后，置于105℃烤箱內24 h后稱其重量為干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5 TUNEL染色檢測神經元凋亡 末次神經功能評估結束后，每組取5只大鼠參考文獻[8]報道的方法進行TUNEL染色。腦組織進行常規切片，PBS清洗，TritonX-100通透，嚴格按照TUNEL試劑盒（美國Invitrogen公司）說明進行操作。隨機選取5個高倍鏡（×400）視野觀察，并計算細胞凋亡率。

1.6 EILSA測定氧化應激和炎癥反應指標 末次神經功能評估結束后，每組取5只大鼠采用參考文獻[9]報道的方法測定氧化應激和炎癥反應指標。鼠深度麻醉后，斷頭處死，迅速左側大腦半球組織放入無菌生理鹽水中，勻漿后離心（12 000轉/min離心20 min），取上清液。按照EILSA檢測試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）說明操作，檢測上清液腫瘤壞死因子-α（tumor neceosis，factor alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷光甘肽過物氧化酶（glutathione peroxidase，GHS-px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。

1.7 免疫印跡法檢測相關蛋白的表達 末次神經功能評估結束后，每組取5只大鼠采用參考文獻[10]報道的方法檢測相關蛋白的表達。提取腦組織總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶TBST封閉1 h，然后加入一抗[Nrf2（1:500），HO-1（1:500），NF-kB p65（1:500），BCL-2（1:500），cleaved-caspase-3（1:500）；美國Invitrogen公司]4℃孵育過夜，TBST沖洗4次，室溫下加入二抗（1:1 000）。ECL試劑盒顯影并拍照。采用ImageJ軟件進行灰度值分析，以GAPDH作為內參對照。

1.8 統計學處理 采用SPSS 24.0 軟件進行分析；定量資料以±s表示，用單因素方差分析和LSD-t檢驗；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舒芬太尼對大鼠SAH后神經功能的影響 與假手術組相比，模型組大鼠mNSS評分顯著增高（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠mNSS評分顯著降低（P＜0.01 ）。見圖1。

圖1 舒芬太尼對大鼠SAH后神經功能的影響

2.2 舒芬太尼對大鼠SAH后腦含水量的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦含水量顯著增高（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦含水量顯著降低（P＜0.01 ）。見圖2。

圖2 舒芬太尼對大鼠SAH后腦含水量的影響

2.3 舒芬太尼對大鼠SAH后神經元凋亡的影響 與假手術組相比，模型組大鼠神經元凋亡率顯著增加（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠神經元凋亡率顯著降低（P＜0.001 ）。見圖3。

圖3 舒芬太尼對大鼠SAH后神經元凋亡的影響

2.4 舒芬太尼對大鼠SAH后氧化應激和炎癥反應的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平顯著降低（P＜0.01 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平顯著增高（P＜0.01 ）。見圖4。

圖4 舒芬太尼對大鼠SAH后氧化應激和炎癥反應相關指標的影響

2.5 舒芬太尼對大鼠腦組織BCL-2、Nrf2、HO-1、NF-kB p65及cleaved-caspase-3蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦組織BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05 ）。見圖5。

圖5 舒芬太尼對大鼠SAH后氧化應激和細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

SAH后腦損傷常伴有神經元凋亡和腦水腫，這是造成神經功能缺損的主要原因[11]。近年來，越來越多的研究集中于揭示腦損傷的分子機制。研究表明SAH后，腦組織發生多種病理性改變，包括腦缺血、血腦屏障破壞、腦水腫和細胞凋亡[12]。有研究發現，caspase抑制劑可以減少SAH后皮層細胞凋亡和基底膜caspase蛋白表達，改善神經行為功能和腦水腫[13]。caspase-3活化是導致細胞凋亡的關鍵步驟，但是卻可以被BCL-2阻斷。本研究發現舒芬太尼明顯降低大鼠SAH后腦組織含水量、神經元凋亡率以及cleaved-caspase-3的表達水平，明顯增高BCL-2蛋白表達水平。這提示舒芬太尼可能提高抑制caspase-3，緩解腦水腫，減少神經元凋亡。

越來越多的證據表明，神經炎癥在SAH后腦損傷的發病機制中起關鍵作用，抗炎治療有益于改善SAH[14，15]。在SAH早期，小膠質細胞過度激活可以分泌炎癥因子，加重腦損傷，因此抑制小膠質細胞的激活可減輕SAH后腦損傷[16，17]。NF-kB是細胞內重要的核轉錄因子，參與機體的炎癥反應，一旦被激活，促進炎癥因子大量釋放，從而導致炎癥反應。另外，SAH會導致產生過多的活性氧和活性氮，包括羥自由基、超氧化陰離子、過氧化氫、一氧化氮和過氧亞硝酸鹽，消耗了酶促和非酶促抗氧化劑防御系統[18]，導致氧化應激損傷[19]。本研究發現舒芬太尼明顯抑制大鼠SAH腦組織NF-kB p65表達，顯著降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以及脂質過氧化產物MDA水平，顯著增加抗氧化劑SOD和GSH-Px水平。這提示舒芬太尼對大鼠SAH后氧化應激反應和炎癥反應具有抑制作用。

有研究表明在SAH大鼠模型中，苦豆堿通過Nrf2-ARE途徑減少氧化應激損傷，改善神經功能[20]。Nrf2是抗氧化劑，能夠調控細胞氧化損傷，而HO-1是Nrf2-ARE信號通路下游重要的抗氧化與解毒蛋白，對SAH后腦損傷具有減輕氧化應激損傷和抑制細胞凋亡的作用[21]。本研究發現舒芬太尼顯著降低大鼠SAH腦組織Nrf2和HO-1蛋白表達；因此，我們推測舒芬太尼可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解SAH誘導的氧化應激反應。

綜上所述，舒芬太尼對SAH后腦損傷有保護作用，其機制可能其抗細胞凋亡、抗氧化應激和抗炎癥反應等作用有關。