高分辨熔解曲線技術(shù)在篩查21羥化酶缺乏癥患者熱點(diǎn)基因突變中的臨床應(yīng)用價(jià)值*

張新杰，徐曉薇，王朝，王學(xué)韜，呂玲，蔡春泉，舒劍波

(天津市兒童醫(yī)院&天津大學(xué)兒童醫(yī)院a.兒科研究所，b. 內(nèi)分泌科，天津 300134)

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia ,CAH)是一種常染色體隱性遺傳病，其中最為常見的是由CYP21A2基因缺陷引起的21 羥化酶缺乏癥(21-hydroxylase deficiency,21-OHD)，占比高達(dá)90%～95%。在2019年上海浦東召開的臨床遺傳學(xué)高峰論壇上，各專家均呼吁重視罕見病基因攜帶者的篩查。早期的篩查可降低新生兒死亡率、減少因女嬰外生殖器男性化而造成的性別誤判，同時(shí)改善其生長發(fā)育。因此，針對(duì)人群中21-OHD患者及攜帶者的CYP21A2致病基因熱點(diǎn)突變篩查具有重要意義。

21-OHD患者可根據(jù)其臨床表型分為失鹽型、單純男性化型、非經(jīng)典型3種。在失鹽型中最常見的基因突變位點(diǎn)為CYP21A2基因I2G和 p.Q319X位點(diǎn)，在單純型中最常見的位點(diǎn)為I2G和p.I173N位點(diǎn)[1-5]。本研究建立的高分辨熔解曲線(high resolution melting curve, HRM)主要針對(duì)c.293-13A/C>G(I2G)、c.518T>A(p.I173N)、c.955C>T(p.Q319X)以及c.1069C>T(p.R357W)突變進(jìn)行篩查。該技術(shù)具有高靈敏度，可檢測(cè)出基因中單個(gè)堿基的差異，并能初步識(shí)別DNA片段中的序列變體，目前已被成功應(yīng)用于多種遺傳病的基因突變檢測(cè)，包括地中海貧血、Rett綜合征、Klinefelter綜合征[6-8]等。然而，其應(yīng)用于檢測(cè)CYP21A2基因突變的相關(guān)報(bào)道少見[9]。本研究采用HRM技術(shù)篩查21-OHD患者CYP21A2基因突變，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2009年1月至2014年12月于天津市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診或內(nèi)分泌病房住院且未經(jīng)過臨床治療的21-OHD患者15例，其中男7例，女8例，年齡(2.6±2.7)歲。各患者21-OHD特異性實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)——血漿17-羥孕酮(17-OHP)的濃度為(143.3±96.5)ng/mL。同時(shí)排除非21-OHD引起17-OHP升高的11-羥化酶缺陷癥、P450氧化還原酶缺陷癥、17-羥基脫氫酶缺陷癥及17,20-裂解酶缺陷癥等。另收集同期保健門診就診的體檢健康兒童30例作為健康人對(duì)照組，其中男21例，女9例，年齡(6.4±2.2)歲。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.2016021)，各研究對(duì)象及家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 LightCycler?480高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Roche公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop2000超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)。Forget-Me-NotTMEvaGreen qPCR Master Mix(美國Biotum公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(Genomic blood DNA mini kit，北京康為世紀(jì)公司)，TaKaRa LA Taq酶(北京寶生物公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及基因組DNA的提取 采集21-OHD患兒就診時(shí)或住院時(shí)(體檢健康者于體檢時(shí)采集)的空腹靜脈血0.5 mL，EDTA-K2抗凝，采用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，NanoDrop2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，取DNA吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0之間，濃度為15～65 ng/μL的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。DNA樣本置于-20 ℃保存。

1.3.2引物設(shè)計(jì)及普通PCR擴(kuò)增CYP21A2基因 參考文獻(xiàn)[10]中的引物序列及PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。ME008上游引物序列:5′-GCTTCTTGA

TGGGTGATCAAT-3′，退火溫度56.5 ℃；ME066下游引物序列:5′-CTCAATCCTCTGCAGCG-3′，退火溫度61.1 ℃，產(chǎn)物片段大小 3 400 bp。 PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2 μL, 2×La PCR bufferⅠ 12.5 μL，125 U LA Taq酶 0.25 μL，模板DNA 1.5 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)溫度降低1 ℃)，72 ℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，整個(gè)PCR反應(yīng)共計(jì)45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL,經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀掃描并拍照。

1.3.3DNA測(cè)序及序列分析 將部分?jǐn)U增所得的PCR產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas2 .6.4序列分析軟件分析并與GenBank中NCBI參考序列(NC_000006.12，NM_000500.7)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.4HRM引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件對(duì)CYP21A2基因各突變位點(diǎn)所在區(qū)域進(jìn)行HRM引物設(shè)計(jì)。本次研究共設(shè)計(jì)了3對(duì)用于HRM檢測(cè)的引物，其中c.955和c.1069共用同一對(duì)引物。所有的HRM引物均委托蘇州金唯智公司合成，并采用tPAGE方式純化，見表1。

表1 HRM技術(shù)的特異性引物

1.3.5HRM檢測(cè)所用反應(yīng)條件及結(jié)果分析 PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，包括 10 μL 預(yù)混液(2×PCR Mix)、10 μmol/L正、反向引物各1 μL，1 ngCYP21A2基因DNA模板。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸10 s, 共45個(gè)循環(huán)。HRM熔解曲線分析條件：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，數(shù)據(jù)收集從65 ℃～95 ℃，溫度上升為1 ℃/s，且每升高1 ℃ 進(jìn)行25次數(shù)據(jù)采集，將所獲取的數(shù)據(jù)使用 LightCycler?480高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行熔解曲線和差異圖分析。為排除單次實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)誤差，將所有經(jīng)過測(cè)序的突變型樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算CYP21A2基因4個(gè)突變位點(diǎn)相應(yīng)突變型的熔解Tm值的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2.121-OHD患者CYP21A2基因突變結(jié)果分析 對(duì)15例21-OHD患者的CYP21A2基因進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。在15例患兒中有9例為單一位點(diǎn)的純合突變，另外6例均攜帶2個(gè)不同位點(diǎn)的雜合突變。

表2 CYP21A2基因4個(gè)突變位點(diǎn)相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2CYP21A2基因在c.293-13位點(diǎn)的PCR-HRM分析結(jié)果 針對(duì)CYP21A2基因上的c.293-13位點(diǎn)所建立的HRM分析方法能較好地區(qū)分致病位點(diǎn)的基因型，該位點(diǎn)是1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，AA和CC均為野生基因型，用30例已經(jīng)完成基因測(cè)序的健康人樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證，沒有發(fā)現(xiàn)突變型，其典型的基因測(cè)序圖和差異熔解曲線見圖1。

注：A,c.293-13野生CC基因型;B,c.293-13野生型AA基因型;C, c.293-13純合突變基因型; D, c.293-13雜合突變A>G基因型;E, c.293-13雜合突變C>G基因型;F, c.293-13位點(diǎn)的差異熔解曲線；箭頭示突變位點(diǎn)。

2.3CYP21A2基因在c.518位點(diǎn)的PCR-HRM分析結(jié)果 應(yīng)用上述方法對(duì)CYP21A2基因上c.518位點(diǎn)進(jìn)行HRM分型檢測(cè)，其典型的基因測(cè)序圖和差異熔解曲線結(jié)果見圖2。

注：A,c.518野生TT基因型;B, c.518純合突變基因型;C, c.518雜合突變T>A基因型; D, c.518位點(diǎn)的差異熔解曲線；箭頭示突變位點(diǎn)。

2.4CYP21A2基因在c.955和c.1069位點(diǎn)的PCR-HRM分析結(jié)果 將CYP21A2基因中c.955C>T和 c.1069C>T這2個(gè)位點(diǎn)置于同一片段中，應(yīng)用上述方法進(jìn)行HRM檢測(cè)，其典型的基因測(cè)序圖和差異熔解曲線結(jié)果見圖3。

3 討論

為了保證HRM能準(zhǔn)確地檢測(cè)21-OHD的致病基因CYP21A2，本研究應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行了初步擴(kuò)增。Tusié-Luna等[11]和Prado等[12]報(bào)道在距離CYP21A2基因30 000 bp的位置上存在1個(gè)與之高度同源的假基因CYP21A1P，且這2個(gè)基因在外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的同源性分別高達(dá)98%和96%。故而，在本研究中應(yīng)用PCR技術(shù)初步擴(kuò)增CYP21A2基因特異性地排除假基因的干擾顯得尤為重要。本研究進(jìn)一步將c.955C>T和c.1069C>T這2個(gè)相近位點(diǎn)設(shè)計(jì)在同一段PCR片段上進(jìn)行擴(kuò)增，突變位點(diǎn)在PCR產(chǎn)物中的位置并沒有影響HRM技術(shù)掃描分析的準(zhǔn)確性，真正起影響作用的是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，這與Reed等[13]的報(bào)道相似。本研究建立的CYP21A2基因HRM分析方法能很好地區(qū)分突變型與野生型的標(biāo)本，Tm值CV均較低，為后續(xù)臨床分析提供了一定的技術(shù)支持。

HRM是一種快速、可行、廉價(jià)且易于使用的方法。根據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，相對(duì)于Sanger測(cè)序14元/樣品的成本，HRM檢測(cè)可以將每個(gè)患者的成本降低至3元/樣品，且其結(jié)果可以在半個(gè)工作日內(nèi)獲得，而Sanger測(cè)序需要1～2個(gè)工作日。此外，如Jones等[14]報(bào)道的低水平的等位基因嵌合如果只通過基因測(cè)序手段極容易被漏檢，而HRM的檢測(cè)原理是基于核酸分子的基本特性，故能很好地避免這個(gè)問題。因此，將HRM用于大規(guī)模基因突變篩查及基因分型對(duì)于擁有大量患者的實(shí)驗(yàn)室極具吸引力。

注：A,c.1069野生CC基因型;B, c.1069雜合突變C>T基因型;C, c.1069純合突變基因型; D, c.955野生CC基因型；E, c.955雜合突變C>T基因型；F, c.1069和c.955位點(diǎn)的差異熔解曲線;箭頭示突變位點(diǎn)。

HRM在21-OHD臨床檢測(cè)中也具有廣泛的應(yīng)用策略。據(jù)21-OHD臨床實(shí)踐指南總結(jié)[15]，典型21-OHD的發(fā)病率依國家和地區(qū)的不同約為1∶14 000～1∶18 000。因此，在人群中大規(guī)模快速篩查高頻致病突變，輔助完善21-OHD的基因突變譜研究十分必要。此外，在臨床特殊群體如多囊性卵巢綜合癥(PCOS)患者中，利用本研究中的HRM檢測(cè)方法也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Livadas 等[16]曾報(bào)道PCOS與非經(jīng)典型CAH具有相似的臨床特征，如高雄激素血癥、多毛癥、排卵和月經(jīng)功能障礙等。僅憑臨床表現(xiàn)區(qū)分該2種疾病是有一定難度的，對(duì)具有這類癥狀的患者，鑒別診斷PCOS和非經(jīng)典型先天性腎上腺皮質(zhì)增生(CAH)是正確治療的關(guān)鍵。Moran等[17]曾報(bào)道在育齡女性和患有高雄激素血癥的女性群體中，PCOS患病率較非經(jīng)典型CAH升高40～50倍；Legro等[18]也建議，應(yīng)該在高風(fēng)險(xiǎn)人群中，包括具有PCOS相應(yīng)癥狀的女性中篩查非經(jīng)典型CAH。所以，在基數(shù)略大的PCOS患者中利用本研究所建立的HRM檢測(cè)方法進(jìn)行21-OHD基因篩查具有良好的應(yīng)用前景。本研究建立的針對(duì)CYP21A2基因致病突變HRM的檢測(cè)方法適合在高危人群或臨床可疑患者中進(jìn)行篩查，為后期對(duì)于21-OHD的流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有效和便利的手段，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究的局限性及不足之處在于目前HRM主要應(yīng)用于致病基因已知的單基因遺傳病的突變篩查，報(bào)告受測(cè)基因序列中多存在1個(gè)或多個(gè)變異，因而不能完全取代基因測(cè)序。特別是針對(duì)CYP21A2基因上致病的嵌合重組以及大片段缺失，仍需要結(jié)合多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)進(jìn)行檢測(cè)。但它確實(shí)可將測(cè)序工作縮減為在HRM檢測(cè)陽性后的確證和對(duì)精確突變或多態(tài)性的最終診斷。此外，本研究中建立的HRM檢測(cè)方法未包含全部CAH的常見致病變異位點(diǎn)，這也是我們后續(xù)進(jìn)一步研究的方向。