與兒童哮喘相關的易感基因的研究進展*

林佳輝，閆露露，解敏，王飛，李海波，陳怡博

(1.寧波大學醫學院，浙江寧波 315000；2.寧波市杭州灣醫院兒科，浙江寧波 315000；3.寧波市婦女兒童醫院 a.出生缺陷綜合防治重點實驗室，b.檢驗科，浙江寧波315000)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡稱哮喘)是一種遺傳和環境因素相互作用導致的多基因遺傳病[1]，臨床癥狀為喘息、咳嗽、胸悶、呼吸困難。目前全球約有3.34億人患有哮喘，且哮喘患病率持續上升[2]。研究估計，哮喘遺傳度約為50%～90%，且兒童患病率高于成人[3]。從基因組角度考慮，疾病易感基因是指在適宜環境刺激下能夠編碼遺傳性疾病或獲得疾病易感性的基因[4]。通過易感基因相關基因頻率和影響效應的情況，可將遺傳疾病分為復雜遺傳性疾病和孟德爾遺傳病。常見的復雜疾病如高血壓、糖尿病等均具有易感基因。本文就兒童哮喘相關易感基因發現的研究方法、近年來發現的主要易感基因、易感位點間交互作用及環境因素等作一綜述，以期為兒童哮喘易感性的基因篩查提供依據。

1 可發現哮喘相關易感基因的技術

1.1通過定位克隆發現哮喘易感基因 定位克隆法識別哮喘易感基因主要依靠對哮喘家系進行分析研究，該方法是選擇在人類的基因組遺傳圖譜中大量遺傳標記，對家系成員進行全基因組掃描，同時通過連鎖分析方法將哮喘的有關基因位點定位到所選染色體區域內再進行精確定位，從而最終識別出哮喘相關易感基因。這些基因位點的基因型是在多個哮喘個體的家庭成員中鑒定的，各成員具有相似臨床表現且共同遺傳標記位點緊密連鎖的區域，在理想狀態下可鑒別相關基因或突變基因型。但定位克隆的染色體區域通常較大，也會因目標易感基因的重組等情況而造成定位失敗。既往通過這種研究方法確定了8個哮喘易感基因：解整合素金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotease 33，ADAM33)、二肽基肽酶10(dipeptidyl peptidase 10，DPP10)、PHD 鋅指蛋白 11(PHD finger protein 11，PHF11)、哮喘相關G蛋白耦聯受體(protein related receptor for asthma,GPRAG)、人白細胞抗原-G(human leucocyte antigen-G，HLA-G)、細胞質脆性X智力低下蛋白結合蛋白2(cytoplasmic FMR1-interacting protein 2，CYFIP2)、精氨酸/絲氨酸富集剪接因子8(splicing factor, arginine/serine-rich 8, SFRS8)和視蛋白基因 3(opsin 3，OPN3)[5-12]。其中ADAM33是第1個被發現的定位克隆的哮喘相關基因[13]，并證實其序列變異與哮喘發生有關，同時與支氣管高反應性、早期肺功能、整個生命周期的肺功能下降以及慢性阻塞性肺疾病等相關。

1.2通過候選基因關聯分析發現哮喘易感基因 候選基因法是將有一定研究基礎且感興趣的基因作為候選基因，擇其中的多態性標記，在哮喘病例組和對照組中比較多態性標記的基因型相關頻率分布的差異，從而確定與疾病表型有關的基因。但這種研究方法只是在小的、低效能的隊列中進行，因而也容易出現假陽性，許多結果不能在其他人群中重復。通過候選基因關聯分析，盡管能發現是否存在遺傳學的相關性，但也可能遺漏了能夠代表疾病病理生物學的真正原因。目前涉及哮喘病因學的候選基因研究有100多個[14]，其中只有不到10%的基因在超過10項研究中得到了重復。比較有研究前景的哮喘候選基因包括白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素13(interleukin-13，IL-13)、白介素4受體α鏈(interleukin 4 receptor alpha chain，IL-4RA)、β2腎上腺素能受體(beta2-adrenoreceptor，ADRB2)、高親和力IgE受體β亞基(beta subunit of the high affinity IgE receptor，FCER1B)、腫瘤壞死因子A(tumor necrosis factor A，TNFA)、表面抗原基因白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)以及組織相容性基因HLA-DRB1和HLA-DQB1。

1.3通過定位克隆與候選基因關聯分析發現的價值性哮喘易感基因 Ober等[14]對上述兩種方法所發現的哮喘或變應性疾病的易感基因進行檢測，共分析118個有關基因，其認為重復在6個及以上獨立樣本的25個基因是具有價值的易感基因[14]，包括：(1)重復>10個樣本的基因：IL-13、IL-4RA、IL4、ADRB2、ADAM33、CD14、HLA-DQB1、FCER1B、TNF、HLA-DRB1；(2)重復6～10個樣本的基因：CC16、TBXA2R、CCL5、TGFB1、NOS1、NOD1、GSTP1、STAT6、CTLA4、LTC4S、GSTM1、LTA、IL10、GRPA、SPINK5。

其研究還發現獨立樣本重復率最高的哮喘基因，主要包括IL-13、IL-4RA、IL4、ADRB2和FCER1等。其中IL-13、IL-4、ADRB2和FCER1B基因表達量的改變與IgE相關水平升高有關，而IgE介導的炎癥反應是過敏性哮喘的重要環節。關于IL-13基因報道最多的氫核氨酸多態性(SNP)為2044A>G，其降低了IL-13和受體結合間親和力，促使局部IL-13濃度增加，從而增強與受體結合后的信號轉導，引起嚴重哮喘。IL-4RA基因中E375A和Q551R 2個SNP位點與IgE水平升高、肥大細胞增多有關，造成嚴重的哮喘惡化及肺功能降低[15]。IL-13與IL-4RA對血漿總IgE水平具有明顯的協同影響，二者通過相同的信號轉導途徑，促使B細胞向合成IgE的途徑轉換，從而增加哮喘易感性[16]。ADRB2位于B細胞上，可在變應原進入體內后被刺激， 從而促使B細胞分泌IgE[17]。而FCER1中的組合部分β亞單位(FCER1B)在FCER1表達和信號轉導過程中起到放大作用，促進肥大細胞和嗜堿性粒細胞活化，從而上調IgE介導的炎癥反應。

1.4全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)發現哮喘易感基因 伴隨人類基因組技術的發展，高通量基因分型平臺使研究成本持續降低，GWAS等關鍵分析方法的發展使得基因組掃描更加密集。其可對整個基因組中成千上萬的SNP進行同步分析，并且這些SNP通常是由獨立的病例和對照樣本確定的。這種方法的突出優點是在未知疾病的情況下可以檢測出致病基因的影響，發現與疾病相關的新的易感基因及通路[18]。GWAS研究方法是將研究對象的DNA在lllumina系列芯片上進行基因分型，所發現的SNPs采用Plink系列軟件如(v1.07)進行薈萃(meta)分析，然后采用EIGENSTRAT軟件對潛在群體分層進行調查，并對頂級特征向量進行Logistic回歸，得出OR值(odds ratio)和用于meta分析的標準誤差。但是此方法通常需要較大的樣本量及盡可能多的變量的覆蓋率，從而有充足的統計能力以檢測基因與疾病相關性是否顯著。隨著全球GWAS的廣泛開展，目前已經發現約1 000個哮喘候選基因[19]。一項2007年的GWAS研究[20]發現，在不同的種族中，重復頻率最高的哮喘基因簇位于染色體17q12-21上。一項大規模的研究進一步表明，該基因組區域是特定于兒童哮喘發病的原因，其變異能夠調節多個基因的表達水平，包括血清類黏蛋白3(orosomucoid 3，ORMDL3)、抗原B(gasdermin B，GSDMB)和抗原A(gasdermin A，GSDMA)[21]。此外，在哮喘發展過程中，17q21位點的基因型與早期呼吸道感染有關[21]，且17q21基因變異和早期生活環境中煙草煙霧暴露會增強早期呼吸道感染與早發哮喘和兒童哮喘之間的聯系。另有研究發現[22-23]，透明帶結合蛋白2(ZPBP2)基因是兒童和成年哮喘的共同基因座，這一發現在多個位于ZPBP2和GSDMB基因內SNP及致病變異的研究中得到了證實[22-23]。另有學者通過對來自歐洲人群13 556名兒童和成人進行薈萃分析，發現位于ZPBP2啟動子區域的1個SNP(rs11557467)與哮喘顯著相關(T的等位基因OR為1.32,P=3.29×10-15)[22]。近年來通過GWAS方法新發現的一些主要與兒童哮喘候選基因及位點見表1。

表1 全基因組關聯分析中發現的主要易感基因及位點[22-25]

1.5轉錄組學發現哮喘易感基因 除了基因組學，其他組學技術也是目前了解哮喘病理生理的重要手段。組學研究主要集中于各種生物來源數據，包括基因組修飾(表觀基因組學)、基因組轉錄(轉錄組學)、蛋白質水平和化學修飾(蛋白質組學)、內源性和外源性代謝產物(代謝組學)和微生物組(宏基因組學)。與其他疾病相比，轉錄組學在哮喘中的應用尚處于起步階段。轉錄組是所選活細胞中可能轉錄出的所有RNA的總和，用于研究細胞的表型和功能。轉錄組學提供定量和定性的表征或RNA轉錄本，可以提供或證實GWAS識別的哮喘基因位點的機制解釋[18]。這些主要是側重于比較特定控制條件下細胞或組織中的基因表達水平，以識別可能對研究中的疾病有(單獨或聯合)功能影響的差異表達基因。有學者運用轉錄組技術在2年內研究133名兒童哮喘患者和11個亞洲血統的健康人對照組外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)基因表達，結果發現PBMC基因表達譜有助于鑒別治療控制不良的TH1/TH17介導的哮喘，且PBMC和CD8+T細胞可能是研究和鑒定重癥哮喘的重要靶點[26]，并認為外周血是兒童研究中最適合的樣本[18,26]。結合完整的臨床和組學數據有助于更好地解釋哮喘病理生理學生物過程，并幫助定義哮喘亞型，改善對病情嚴重程度評判和治療反應，顯示出更高的預測能力。

2 基因位點的交互作用

哮喘是多基因病，發病機制復雜，隨著研究深入，逐漸證實不同基因位點間存在交互作用，影響哮喘的發病幾率。有學者通過追蹤1 000例出生隊列的研究，發現多個哮喘基因位點組合可預測哮喘的臨床發病及臨床表現等[27]。國內有學者在漢族兒童中選取報道重復率高的哮喘易感基因中的多個SNP進行研究，結果發現SNP越多，發病風險度增高，單個位點者風險度是無變異者的2倍，而含2個位點者危險度可增至約6倍，9個位點者患病風險甚至達16倍。其進一步研究發現，由IL-13(-1112C>T、+1923C>T、R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)、FCER1B(-109C>T、E237G)、IL-4RA(I75V、Q551R)組成的模型哮喘預測準確率達80%以上。優化所得IL-13(R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)和FCER1B(E237G)構成的4位點哮喘預測模型的準確度為80.00%[28]。國外有學者構建了由EOT2(+1272A>G、+304C>A)、EOT3(+77C>T、+716A>G、+1579G>A)組成的5位點預測模型，并證實其對韓國群眾的哮喘易感預測準確性達64.3%[29]。盡管這些模型局限于所針對的目標人群，但它們在一定條件下提示多位點對哮喘發生風險具有一定的預測價值。

3 基因與環境交互作用

盡管基因對哮喘及其相關性狀有重要作用，但多種環境暴露也同樣影響哮喘的發生。在哮喘預測時，早期生活的暴露具有很高的關聯，包括呼吸道感染、腸道和呼吸道微生物影響和煙草煙霧吸入等。人們已通過多種方式識別基因-環境存在相互作用。一項最新的GWAS研究分析了遺傳變異與交通相關空氣污染的相互作用，證實交通工具排放的二氧化氮會導致哮喘癥狀的惡化，并可能降低肺功能[30]。另一項歐洲兒童的GWAS研究發現，ADCY2、B4GALT5和DLG2基因與環境相互作用對哮喘的發生發展具有重要意義[31]，嬰兒出生時NO2暴露會顯著影響這3個基因的表達，同時也增加NO2相關的外周血細胞表達水平，從而增加哮喘發作。

4 易感基因對藥物的治療反應相關影響

目前國內治療哮喘最常用的藥物主要是β2受體激動劑、吸入皮質類固醇(ICS)及白三烯調節劑。盡管大多數患者在使用藥物治療后哮喘癥狀緩解，但對于不同人群，哮喘的治療效果有很大差異。研究顯示易感基因也同時影響哮喘的治療效果。因此，哮喘治療藥物反應性與相關基因位點關系的研究，可能更有助于在未來確定特定的藥物遺傳學特征，將為臨床治療患者帶來更精準的治療方案。有學者通過對患有哮喘的非洲裔美國兒童進行了支氣管舒張反應的GWAS研究，發現染色體9q21上存在1個顯著相關的SNP位點(rs73650726,P=7.69×10-9)，且在非裔美國人和拉丁美洲人的跨種族研究中發現了另外3個SNP與支氣管舒張反應顯著相關的PRKG1基因的內含子(rs7903366、rs7070958、rs7081864,P=5×10-8)，證實了支氣管舒張反應的遺傳基礎可能在種族或民族之間存在差異[32]。也有研究者通過對接受吸入型糖皮質激素(inhaledcorticosteroids,ICS)治療的哮喘患者的基因型分析，以確定ICS應答的遺傳標記，但其并未得到明確結論[33]。目前藥物遺傳學仍然不能直接應用于預測哮喘患者治療的臨床結果。

5 結語與展望

目前越來越多的哮喘易感基因逐漸被發現、驗證，基因組研究的工具日漸進步，顯著提升我們對復雜疾病的認識。哮喘及其易感基因的發現、定位和遺傳機制具有重要的科學及臨床價值。哮喘受遺傳及環境因素共同影響，在深入遺傳因素本質的同時，澄清哮喘的相關環境影響也同樣重要，從而能直接地識別和重現環境可塑的遺傳效應。盡管目前我們對哮喘的相關遺傳因素了解有限，藥物遺傳度還不能直接應用于遺傳預測，但隨著基因組醫學技術的不斷進步，對探究哮喘更深的遺傳機理、通過基因層面預測哮喘進展和治療反應帶來了更大期待。總之，發現更多的哮喘易感基因及了解其交互作用，將為哮喘的臨床預測及治療帶來更多可能。