microRNA在復發性流產中的研究進展*

王志琴，謝開鵬，鐘天鷹

(南京醫科大學附屬婦產醫院，南京市婦幼保健院a.醫學檢驗科，b.醫學研究中心，南京 210000)

復發性流產(recurrent spontaneous abortion, RSA)一般指與同一性伴侶連續發生3次及3次以上的自然流產[1]。不同國家或地區對RSA定義存在爭議，爭議點主要是流產發生的孕周、次數、是否連續發生、以及是否為同一性伴侶[1-2]。RSA的發病原因復雜，早期RSA的最常見原因是胚胎染色體異常，晚期RSA最常見原因為子宮解剖異常[1]。目前，臨床上診斷或預測RSA的檢測指標效能不佳，部分原因明確的RSA和不明原因的復發性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的治療仍然是婦產科領域的難點和挑戰。

微RNA(microRNA, miRNA)是一種短小分子的非編碼單鏈RNA，其長度約為22個堿基，廣泛參與機體的病理、生理過程[3]。人類許多疾病都與miRNA的異常表達有關，包括癌癥、心血管疾病、子癇前期等[4-5]。研究發現，與健康孕婦相比，RSA患者血液、絨毛和蛻膜組織中的miRNA表達存在顯著差異性[6-8]，這為探索RSA的發生機制提供了新的思路。由于miRNA本身具有較好的穩定性和組織特異性，因此，miRNA有可能成為RSA的診斷標志物[3,9-10]。本文通過綜述RSA相關miRNA的研究進展，以期為RSA的診療提供新思路。

1 人群關聯研究

RSA的人群關聯研究通常所用的樣本為蛻膜組織[6]、絨毛組織[8]、血漿[8]、血清[8]，所用的對照組多為人工流產的正常孕婦(normal pregnancy, NP)手術前采集血樣或手術時采集蛻膜或絨毛組織。研究設計上一般首先采用miRNA芯片[11-12]或深度測序技術[13-14]獲得差異miRNA表達譜，常見的選擇標準有差異倍數(Fold-change, FC)≥2(或≤0.5)且P<0.05[11,15-17]；然后再從表達譜中選擇幾個miRNA通過實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)進行驗證。以下根據研究所用的樣本類型分類進行敘述。

1.1蛻膜組織 蛻膜在妊娠前3個月侵入子宮黏膜，是控制滋養層入侵深度的關鍵，蛻膜含有較多的自然殺傷細胞(natural killer cells, NKCs)，且與血液中NKCs的表型和功能顯著不同[6]。有學者發現，蛻膜組織自然殺傷細胞(decidual natural killer cells,DNKCs)可分泌血管內皮生長因子C，介導滋養細胞的侵襲和血管重構[18]，故而蛻膜及其免疫細胞對維持妊娠起重要作用。Li等[6]通過文獻復習選出了6個可能與URSA發生、發展有關的miRNA(miR-34a、miR-155、miR-141、miR-125a、miR-125b、miR-24)；隨后收集了20對URSA患者和NP婦女的蛻膜組織，用qRT-PCR檢測DNKCs中該6個miRNA的表達水平，結果顯示miR-34a、miR-155、miR-141、miR-125a、miR-125b表達上調，miRNA-24表達下調；該課題組進一步采用miRNA芯片檢測了5對URSA患者和NP婦女蛻膜組織中DNKCs的miRNA表達譜，結果發現50個差異表達的miRNA(49個上調，1個下調)[15](FDR<0.05，P<0.005)；然而，該50個表達差異的miRNA并不包括前一項研究中的6個差異表達的miRNA，分析原因可能是二者所用的樣本量和檢測技術的不同造成的。Zhao等[12]收集14例RSA 患者和13例NP婦女的蛻膜組織進行了病例-對照研究，采用基因芯片和層次聚類方法篩選出了17個差異表達的miRNA；進一步通過定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)證實了其中4種表達上調(miR-150、miR-365、miR-10a、miR-27c)，4種表達下調(miR-24、miR-30c、miR-181、miR-20)。另有學者發現，miR-24在RSA蛻膜組織[12]和URSA蛻膜組織[6]DNKCs中均表達下調。然而，目前研究中，不同學者研究所得的RSA蛻膜組織miRNA譜中沒有表達趨勢一致的miRNA。

1.2絨毛組織 胎盤絨毛組織對建立胎盤循環和胎兒的物質交換至關重要，同樣，用絨毛組織作為樣品篩選差異性表達miRNA的研究中，不同研究所得的miRNA表達譜中也很少有相同的miRNA[8,11,13]。Gu等[14]通過深度測序篩選了3對RSA和NP患者絨毛組織中差異表達的69個miRNA，其篩選標準為FC>1.5且P<0.05；隨后該研究者收集12例RSA和10例NP婦女的絨毛組織，進一步使用qRT-PCR及動物實驗證實了RSA絨毛組織中miR-486-3p表達下調，miR-3074-5p表達上調。但其他學者[8,11,13,16]用絨毛組織篩選所得的差異性miRNAs中并不包括這2個miRNA，存在差異的原因可能是不同研究者選擇不同的篩選技術和檢測平臺(不同實驗室)所致，有的選擇miRNA芯片[11,16]，有的選擇深度測序技術[8,13]，即便選擇同一種技術，不同實驗室檢測平臺的檢測效能可能差異較大。

1.3血液 血液循環miRNA的研究對RSA診斷標志物和無創檢測技術的探索有重要的意義。Karami等[7]在一項病例-對照研究中比較了25對URSA患者和NP婦女血漿miR-21的表達水平，發現URSA患者血漿miR-21的表達水平顯著降低，同時該研究也比較了25對URSA患者和NP婦女外周血單核細胞中miR-21的表達水平，結果顯示URSA患者外周血單核細胞中miR-21的表達水平也顯著降低；但Yang等[8]和Qin等[17]所篩選的差異性循環miRNA和候選miRNA標志物中均不包括miR-21。Yang等[8]收集了16例RSA患者和29例NP婦女的外周血樣本進行病例-對照研究，并通過Logistic回歸分析分別評估血漿和血清中2個組合模型(組合模型一：6個miRNA：miRNmiR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-29a-3p，miR-100-5p，miR-127-3p，miR-486-5p；組合模型二：2個miRNA：miR-127a-3p，miR-486-5p)預測復發性流產的預測性能、敏感性、特異性、分類正確率，結果發現血漿組合模型一診斷RSA的敏感性和特異性分別為100%和83.3%，其評估后認為循環miR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-29a-3p，miR-100-5p，miR-127-3p，miR-486-5p是非常有潛力的RSA預測因子。Qin等[17]通過基因芯片和qRT-PCR在血漿中篩選出了5個miRNA(miR-320b、miR-146b-5p、miR-221-3p、miR-559，miR-101-3p)，其認為這5個miRNA具有作為URSA生物學標志物的潛力。

關于RSA的人群研究情況見于表1(部分未在文中描述)。通過病例-對照研究可篩選差異性表達的miRNA，這為RSA的生物標志物篩選和進一步機制探索提供了研究方向，但是已有的研究的最大問題是不同研究者篩選所得的差異性表達miRNA不一致，人群的種族來源、樣本量大小、樣本收集的排除及納入標準，以及提取miRNA的技術、差異性miRNA篩選技術、不同實驗室技術平臺敏感性和特異性、統計學指標的選擇等均有所不同，這些可能是導致不同研究篩選結果差異較大的原因，故需擴大樣本量、規范樣本的排除及納入標準、應用更精確的篩選和驗證檢測技術以提高研究結果的可靠性。

表1 RSA人群研究中miRNA的研究情況

2 分子機制研究

目前多數關于miRNA在RSA方面機制功能研究首先通過生物信息學數據庫進行靶基因預測、通路分析、基因本體論分析、相關轉錄因子預測等，然后進行體外實驗或體內實驗驗證[19]。靶基因預測常用的數據庫是TargetScan Release、miRanda[6,15]；基因本體論分析(Gene ontology analysis)包括細胞組分、分子功能、生物過程3個方面；通路分析(Pathway analysis)常用數據庫為《京都基因與基因組百科全書》(KEGG：Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、Biocarta數據庫、Reatome數據庫[6,15]。

2.1miRNA與細胞的增殖、凋亡 Zhang等[21]認為miR-184以野生型p53誘導基因1(wild-typep53-induced gene1,WIG-1)作為靶基因上調Fas的表達，進而促進HTR-8人絨毛膜滋養層細胞的凋亡；Zhao[12]等通過基因芯片、層次聚類法、qPCR法篩選出在蛻膜中差異性較大的miR-365，再經過靶基因預測和HTR-8/SVneo及HPT-8人絨毛膜滋養層細胞實驗，驗證了上調的miR-365以血清/糖皮質激素調節激酶1(serum glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)基因為靶基因，降低SGK1的表達，促進滋養細胞凋亡，參與RSA的發生。另有學者通過蛻膜細胞轉染實驗顯示，miR-378a-3p模擬物可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，而黃體酮可以誘導蛻膜細胞中miR-378a-3p的表達，而miR-378a-3p下調可誘導蛻膜細胞凋亡[22]。由上述研究可推測一種妊娠重要細胞(比如蛻膜細胞等)的增殖、凋亡同時受多個miRNA調控，關于妊娠重要細胞增殖、凋亡的miRNA調控網絡和機制有待更多研究者的探索和揭曉。

2.2miRNA與妊娠免疫耐受 胎兒是同種半異體移植物，正常母體不排斥胎兒的具體機制尚不清楚。HLA-G被認為賦予胎兒-母親免疫耐受功能，以確保妊娠成功，且在整個孕期表達于胎盤組織，Wang等[11]研究發現，RSA患者絨毛組織中miR-133a的表達上調，可通過靶向抑制HLA-GmRNA的翻譯而顯著降低HLA-G蛋白的表達水平，該結果雖然提示miRNA可能調控妊娠免疫耐受，但是還需要更深入的體外實驗和體內實驗驗證。

2.3miRNA與胎盤血管生成 胎盤血管的物質交換功能是保證胎兒健康生長發育的關鍵，Zhu等[19]發現，RSA患者絨毛和蛻膜中顯著上調的miR-16能抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和成管，而miR-16的下調會逆轉這些效應，雖然此項研究結果提示miR-16對胎盤血管生成可能有重要作用，但是miR-16對人類胎盤血管生成的具體機制尚無更詳細的研究。 miRNA可能通過影響胎盤組織的細胞增殖、凋亡、血管生成、免疫耐受參與復發性流產的發生。miRNA調節機制非常復雜[9,17]，1條miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA也可以有相同的靶基因或效應，miRNA如何參與復發性流產機制的研究目前還沒有突破性的研究。

3 目前研究需改善方面

3.1人群研究對照的選擇 目前的人群研究皆以人工流產的健康孕婦為對照篩選RSA的差異性miRNA表達譜，但懷孕是一個動態變化的過程，孕婦的懷孕過程是否順利，胚胎是否發育健全，胎兒是否健康，這些都應該是健康孕婦作為對照的關鍵，而流產的健康孕婦的胚胎是否能夠發育健全，胎兒發育是否健康，整個孕期是否順利，都是無法保證的，故而用孕期順利并且能夠最終分娩健康胎兒的正常孕婦作為對照可能會獲得質量更高的差異性miRNA表達譜。

3.2循環miRNA的來源 盡管RSA miRNA的相關研究未提出miRNA的來源問題，但已有研究表明胎盤來源的核酸會釋放到母體血漿中[23]。有些研究發現同一miRNA在不同標本中的表達趨勢是相反的，例如Yang等[8]研究發現，血漿和血清中miR-23a-3p、miR-127-3p和miR-486-5p的表達水平是相反的，其認為出現這種現象的原因可能是miRNA的來源不同，所以探索RSA循環miRNA的來源可能會成為這個領域的研究方向。

一項關于產前診斷的研究通過比較miRNA在胎盤與外周血細胞表達的倍數，篩選出了4種胎盤表達豐富的miRNA(miR-141、miR-149、miR-299-5p和miR-135b)，并研究了10對分娩前后母體血漿中這4種miRNA的血漿檢出率，結果表明，其檢出率分別為：miR-141[100% (分娩前檢出率)，50% (分娩后檢出率)]，miR-149(80%，0%)，miR-299-5p(50%，20%)，miR-135b(20%，0%)，其中血漿miR-141隨著妊娠進展濃度升高，該研究還探索了miRNA-141在母體血漿中的物理性質，因為絨毛膜生長催乳素1(chorionic somatomammotropin 1, CSH1)轉錄本在分娩前母體血漿中較容易被檢測到，所以通過比較miRNA-141與CSH1編碼的mRNA的穩定性，評估miR-141的穩定性，將血漿通過不同孔徑過濾器過濾和純化后檢測miR-141的表達量變化，結果顯示miR-141在母體血漿中的表達水平更加穩定[24]，這種妊娠相關miRNA動態變化和穩定性研究對RSA miRNA研究有啟發意義。眾多研究篩選出的差異miRNA表達譜差異較大也可能是因為不同孕周的RSA患者的miRNA表達有差異性，所以，研究健康孕婦的差異性表達miRNA，并確定其在整個懷孕過程中的動態變化，進一步確定不同孕周發生流產的差異表達miRNA，這對探索miRNA在RSA中的功能機制具有重要的意義。

3.3miRNA檢測技術 miRNA檢測是miRNA臨床研究的重要部分，近年有關miRNA表達的臨床研究大多使用深度測序技術[13-14]、miRNA芯片[11-12]、PCR[11-14]這3種技術。深度測序技術是第二代測序技術，又稱高通量測序技術，具有較高的準確性和靈敏度，其主要的優點是能夠發現新的miRNA和區別miRNA的變異，但是該技術價格昂貴，數據分析需要大量的計算支持[25-26]。相比深度測序技術，基因芯片是檢測miRNA表達的傳統技術，成本低，但該技術的檢測靈敏度和特異性低，獲取結果時間長[26]。PCR檢測技術的原理簡單，設備自動化程度很高，使用方便，一般實驗室都可實施，不僅有較高的靈敏度、特異性，還可用于絕對定量，與深度測序和miRNA芯片相比，有較好的重復性[26]。miRNA的PCR反應有其特殊之處，由于miRNA短小，在逆轉錄時，通常會使用miRNA通用的加尾法逆轉錄引物或特異性的莖環法逆轉錄引物，延長miRNA的長度，然后進行qPCR[26-27]。其余高靈敏度的miRNA檢測方式，如電化學檢測技術[25]、表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)[25]，還不屬于臨床研究使用的常見技術。

隨著基因擴增技術、分子標記技術、生物發光技術的進步，miRNA檢測技術的靈敏度和重復性會得到極大提高，及時引入更先進的技術，對于分子量很小的miRNA有非常重要的意義。測序技術向著高通量、高準確度、低成本、長讀取長度的方向發展，最新的第三代測序技術還不成熟，錯誤率高，可靠性差。目前，數字PCR逐漸成為較為流行的miRNA檢測方法，在腫瘤或心血管病miRNA研究中已經得到廣泛使用，數字PCR可以絕對定量檢測miRNA，比qRT-PCR的靈敏度更高[28-29]。臨床研究檢測少量miRNA時，也許可以考慮使用電化學檢測技術等靈敏度很高的miRNA檢測方法。以往研究存在的最大問題是同一檢測方法的重復性差，比如，雖然不同研究者會選擇同一種測序技術，但是因為選擇不同的檢測實驗室測量平臺，結果沒有一致性，所以評估各檢測平臺的測量效能，制定技術平臺指南或標準化方案，增強不同平臺間實驗重復性意義非凡。

4 小結及展望

目前用于RSA的標志物主要是血孕酮和hCG。動態測定血液hCG，其增長速度對妊娠預后有一定的預測作用；體內孕酮呈脈沖式分泌，血孕酮的測定值波動幅度大，對臨床的指導意義不大[1]，所以臨床上沒有很好的檢測指標能夠診斷或預測RSA；在治療方面，依據病因篩查，RSA的治療方式有免疫治療、手術治療、抗凝治療等[1]，但對于部分RSA，其治療仍然是婦產科領域的難點和挑戰。研究表明[22]，miR-378a-3p下調可誘導蛻膜細胞凋亡，而黃體酮可以誘導蛻膜細胞中miR-378a-3p的表達；所以miRNA可能成為RSA的診斷標志物和治療工具。目前，流產相關miRNA的研究尚處于起步階段，未來研究可以通過嚴謹的多階段的人群研究以及隊列研究設計等并輔以體內外分子生物學實驗來剖析其具體的作用機制，這將有助于RSA的預防、診斷和治療，推動該領域發展。