miRNA-21-5P在食管鱗癌患者中的鑒別診斷價值

張國玲,吳賀明,郭蓮怡

(1.錦州醫科大學第一附屬醫院消化內科，遼寧錦州121000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第968醫院放射科，遼寧錦州121000；3.朝陽市中心醫院消化內科，122000)

食管癌是多基因、多階段、多因素共同作用于機體而產生的結果，目前認為是致癌基因與抑癌基因結構及功能異常并不斷累積的過程。食管癌發病原因尚不明確，中國臨床腫瘤學會(CSCO)2020年食管癌診療指南為我國臨床食管癌的診療提供了規范和標準[1]，但臨床上對于食管癌的診斷與篩查仍難以實現早期發現與治療。

微小RNA(microRNA,miRNA)在調控蛋白質編碼過程中具有重要作用[2]。通過mRNA可以調節人體各種組織中蛋白質的表達水平，1個miRNA可以配對多個基因，不同miRNA也可以調控同一基因[3]。研究表明，人類30%～50%的基因受到miRNA調控，在人類生長發育和疾病的發生、發展過程中起著重要調節作用[4]。Guo等[5]研究發現，miRNA表達譜在食管癌組織中存在顯著差異。另有學者發現，miRNA-21-5p (miR-21-5p,has-mir-21-5p)主要存在于17q23.1，且與消化道腫瘤的進展相關，其推測miR-21-5p或可作為食管癌檢測的潛在腫瘤標志物[6]。本研究旨在檢測miR-21-5P在食管鱗癌患者血清及組織標本中的表達水平，評估miR-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的臨床效能。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年12月至2020年3月于朝陽市中心醫院消化內科就診的食管鱗癌患者50例作為疾病組，其中，男32例，女18例，年齡(51.0±3.7)歲。納入標準：均經病理組織學證實為食管鱗癌，且按照2020中國臨床腫瘤學會(CSCO)食管癌診療指南[1]明確診斷。未經任何治療或藥物干預。排除診斷:(1)懷孕或哺乳期婦女；(2)任何器官移植史以及現存的功能性移植物(角膜或毛發移植除外)；(3)嚴重疾病史或由其他證據表明為嚴重疾病或患有任何的疾病使患者不適合參加試驗；(4)同時參加其他臨床研究試驗的患者。另收集同期消化內科就診的胃鏡、病理組織學共同診斷為食管炎(反流性食管炎、藥物等損傷所致食管炎等)患者20例作為相關疾病對照組，其中，男13例，女7例，年齡(50.2±4.0)歲。本研究經朝陽市中心醫院醫學倫理學委員會批準(醫倫審〔2019〕17號)，患者及家屬知情同意。

1.2儀器與試劑 Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)，AERIS-BGO96 PCR基因擴增儀(新加坡藝恩高科技公司)，LightCycler480實時熒光定量PCR分析儀(北京龍躍生物科技發展公司)。miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒(昆明康為世紀公司)。

1.3標本采集 用無抗凝劑的真空管采集食管鱗癌患者及食管炎患者入院時的空腹靜脈血5 mL，室溫凝固，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃保存；收集胃鏡檢查中及手術中食管鱗癌患者癌組織及癌旁組織(距離其超過5 cm處食管粘膜處組織,且經病理組織學證實無癌細胞)；胃鏡檢查中采集食管炎患者組織，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉錄反應 按照miRNA提取試劑盒說明書操作提取各組患者血清及組織中的miRNA，采用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定其吸光度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.9～2.1的樣本用于后續試驗，樣本置于-80 ℃保存。純化提取的miRNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。樣本置于-20 ℃保存。

1.5引物設計及熒光定量PCR 根據NCBI中GenBank數據庫查詢的miRNA-21(NR_029493.1)和U6(NR_004394.1)的基因序列號，采用Primer Express 5.0引物設計軟件設計，并送昆明拓源經貿公司合成。miRNA-21-5P上游引物序列：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游引物序列：5′-AGTGCGTGTCGTGG-3′[7]，退火溫度60 ℃，產物片段大小73 bp。U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，退火溫度60 ℃，產物片段大小106 bp。按照miRNA qPCR Assay Kit說明書操作進行PCR反應，PCR總反應體系為20 μL，包括：2×miRNA qPCR Mixture(ROX) 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O補足至20 μL。在LightCycler480熒光定量PCR分析儀上完成操作。PCR循環參數：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個循環。采用LIMS/BarCode軟件于60 ℃時收集熒光信號并進行熔解曲線分析，結果以2-△△Ct法計算，實驗重復3次。

2 結果

2.12組患者組織及血清miRNA-21-5P的表達水平比較 食管鱗癌組癌組織中miRNA-21-5P的相對表達量為4.36±0.29，顯著高于食管炎患者(0.96±0.07)，差異有統計學意義(t=27.570，P<0.05)。而癌旁組織中miRNA-21-5P的相對表達量為1.31±0.16，與癌組織比較，差異亦有統計學意義(t=20.100，P<0.05)。此外，食管鱗癌組血清中miRNA-21-5P的相對表達量為3.60±0.09，顯著高于食管炎患者(1.01±0.05)，2組間差異有統計學意義(t=24.43，P<0.05)。

2.2血清miRNA-21-5P表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系 根據組織學類型分組對比，在低分化組中miRNA-21-5P的相對表達量較中、高分化組均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；根據腫瘤浸潤的深度分組對比，T3～T4組miRNA-21-5P相對表達量較T1～T2組顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；根據腫瘤組織大小分組對比，淋巴結有轉移組的miRNA-21-5P相對表達量較淋巴結無轉移組顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；根據TNM分期分組對比，miRNA-21-5P相對表達量在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組顯著高于Ⅰ～Ⅱ期組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 miRNA-21-5p的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系

2.3ROC曲線評估組織及血清中miRNA-21-5P的表達對食管鱗癌鑒別診斷的價值 以食管鱗癌患者作為疾病組，食管炎患者作為對照組，ROC曲線分析結果顯示，組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.767(95%CI:0.650,0.859)，當cut-off值為0.39時，其敏感性為88%，特異性為75%。血清miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的AUCROC為0.671(95%CI:0.549,0.779)，當cut-off值為0.63時，其敏感性為80%，特異性為66%。見圖1。

圖1 血清及組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線

3 討論

MicroRNA(miRNA)在調控蛋白質編碼過程中具有重要的應用價值，在人類某些腫瘤及炎癥[8-9](如血管生成、侵入性、轉移和分化)等過程中發揮重要作用。本研究通過檢測食管鱗癌患者血清及組織中miRNA-21-5P的表達，結果發現其在食管鱗癌患者血清及組織中的表達水平均顯著高于食管炎患者，由此推斷食管癌患者血清及組織中miRNA-21-5P表達水平的上調與食管鱗癌的發生密切相關。ROC曲線分析結果顯示，組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.767(95%CI:0.650,0.859)，當cut-off值為0.39時，其敏感性為88%,特異性為75%。而血清miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的AUCROC為0.671(95%CI:0.549,0.779)，當cut-off值為0.63時，其敏感性為80%,特異性為66%。雖然組織中miRNA-21-5P診斷的敏感性及特異性更佳，但由于血清標本更容易采集，更廣泛的應用于臨床，有望成為食管癌鑒別診斷的生物學標志物。

食管鱗癌中miRNA-21-5P作用的分子機制目前尚不明確，仍需進一步研究。王燕忠等[10]研究發現，食管鱗癌患者血清中的STAT3是miRNA-21-5p調控的靶基因，并且與食管癌細胞的增殖和凋亡密切相關。本研究中發現，miRNA-21-5p的表達水平與食管癌分化程度、淋巴結轉移、浸潤程度關系密切，分析原因可能與食管鱗癌發病機制相關。然而，由于本研究納入的樣本數量存在局限性，可能影響臨床鑒別診斷的特異性及敏感性。此外，本研究因組織標本采集不便，未納入健康人對照組，下一步我們將增加健康人對照組，并將地域分布等因素納入研究中，以期闡明其在食管癌中的發病機制及臨床診斷中的作用。