分析前因素對血液乙肝表面抗原檢測的影響*

孫俊艷，何成濤，劉海波，陳躍

(1.淮安市中心血站檢驗科，江蘇淮安 223001；2.南京紅十字血液中心研究室，南京 210003)

乙肝表面抗原(HBsAg)是篩查乙型肝炎最重要的血清學指標，標本質(zhì)量保證是檢測結(jié)果準確性的重要分析前因素[1]，國內(nèi)有學者對實驗室分析中儀器產(chǎn)生影響因素、明顯溶血標本或送檢時間進行研究，指出標本溶血和室溫保存4 h以上可影響檢測結(jié)果準確性[2-3]。但往往標本被非規(guī)范處理后，標本溶血、抗凝不充分等現(xiàn)象表現(xiàn)不明顯，使工作人員無法直觀判斷出標本是否合格，且無法對檢測結(jié)果正確賦值。本研究擬通過設(shè)計5種模式，驗證從標本采集到檢測前各種因素對檢測結(jié)果的影響情況，旨在指導標本的處理流程，最大限度的保證標本質(zhì)量，消除標本對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 STAR 8CH全自動酶免前處理系統(tǒng)、FAME24/20全自動酶免后處理系統(tǒng)(煙臺奧斯邦生物研發(fā)公司)，DL-5M低速冷凍離心機、KH20自動開蓋離心機(湖南湘儀實驗室儀器公司)，EDTA-K2抗凝管(江蘇康健醫(yī)療用品公司)，分離膠促凝管(江蘇康健醫(yī)療用品公司)。HBV酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(北京萬泰股份公司)，酶聯(lián)四項質(zhì)控標準血清(北京康徹思坦生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1研究對象 收集2019年4月至11月于淮安市中心血站自愿無償獻血的300例獻血者的血液標本。女性78例，男性222例，年齡(40±2)歲。納入標準：獻血前征詢、初篩、體檢均符合《獻血者健康檢查要求》2011版要求，均由熟練工作人員進行采集，獻血者知曉本研究，自愿參與。排除標準：獻血前征詢、初篩、體檢不符合《獻血者健康檢查要求》2011版要求，不能參加獻血者；標本采集量不足或標本遭到污染時；標本不能按計劃時間進行檢測的；獻血者依從性差，無法完成本研究者。

1.2.2常規(guī)標本處理步驟 要求同一工作人員采用EDTA-K2抗凝管采集每位獻血者2管血液，每管樣本量為4～5 mL，標本無脂肪、無溶血現(xiàn)象，采集后臨時儲存環(huán)境為2～8 ℃。離心溫度為室溫(18～27 ℃)條件下進行分離，離心半徑21 cm，3 000 r/min離心10 min，2管同時分別進行20次檢測。

1.2.3分組模式 分別采取不同離心溫度、采集到離心不同時間間隔、不同離心和儲存順序、不同標本管類型、不同儲存溫度5種不同模式進行處理，每種方法采樣60人。5種模式中保證標本只有設(shè)計的影響因素不同，其他操作處理方法與常規(guī)操作步驟完全相同。

1.2.3.1不同離心溫度(以CT表示) 2支標本離心時分別采取室溫(18～27 ℃)和4 ℃離心，4 ℃離心使用低速冷凍離心機，離心半徑21.5 cm，3 000 r/min離心10 min，分別編為A、B組。

1.2.3.2采集到離心不同時間間隔 (以Ct表示) 從采集到標本進行離心處理的時間間隔為0 h和8 h的2支標本管分別編為C、D組。

1.2.3.3不同離心和儲存順序 (以Tm表示) 將標本管標本離心后儲存和儲存后離心2種情況的2支標本管分別編為E、F組，E組標本采集后立即離心后儲存于2～8 ℃ 4 h，F(xiàn)組標本采集后立即儲存于2～8 ℃，4 h后進行離心。

1.2.3.4不同標本管類型 (以At表示) 分別采用抗凝和促凝管采集的2支標本管分別編為G、H組。

1.2.3.5不同儲存溫度 (以ST表示) 標本采集后分別進行室溫(18～27 ℃)和立即置于2～8 ℃儲存的2支標本管分別編為I、J組，2種均在對應(yīng)溫度下儲存2 h以上，再進行離心處理。

1.2.4計算公式 配對設(shè)計的標準偏差計算公式為：

注：n為樣本例數(shù),d為同一樣本兩組測量結(jié)果之差，dm為同一樣本兩組數(shù)據(jù)差值平均值。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，利用EXCEL 2007電子表格進行數(shù)據(jù)處理及復合標準差的計算。

2 結(jié)果

2.15種不同的因素對結(jié)果的影響 由表1可見，標本采集后處理時離心溫度、標本采集到離心時間間隔、儲存溫度3種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.004 0、0.003 1、0.002 2，經(jīng)統(tǒng)計，對HBsAg檢測結(jié)果的影響差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。離心與儲存順序、標本管類型2種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.000 3、0.000 2、經(jīng)統(tǒng)計，對HBsAg檢測結(jié)果影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 5種因素對HBsAg檢測結(jié)果影響

2.25種不同的因素的影響程度 據(jù)1.2.4中公式計算離心溫度、標本采集到離心間隔、離心和儲存順序、標本管類型、儲存溫度5種因素復合標準差，結(jié)果分別為0.005 5、0.004 5、0.002 6、0.002 0、0.004 9。影響程度由大到小依次為離心溫度、儲存溫度、標本采集到離心間隔、離心和儲存順序、標本管類型。

3 討論

影響實驗室檢測結(jié)果準確性因素主要有人員、儀器、試劑、實驗方法、標本質(zhì)量等方面。自動化測量儀器的推廣和性能方面的持續(xù)改進、儀器的定期校驗及對室內(nèi)質(zhì)控的重視度增強均可有效控制分析中的各種影響因素。由于分析前的環(huán)節(jié)涉及較多，很多學者[4-5]認為可以通過強化分析前的規(guī)范化加以控制，但工作人員責任心及操作的熟練度差異，使標本的處理流程難以達到預期要求，這給分析前標本質(zhì)量控制帶來很大難度，而實驗室標本接收普遍通過肉眼觀察判斷標本合格性，這為檢測結(jié)果準確性帶來一定的負面影響。

本研究顯示，標本采集后處理時離心溫度、標本采集到離心時間間隔、儲存溫度3種模式對HBsAg檢測結(jié)果具有很大影響。筆者分析原因認為，常溫離心時隨著離心時間加長，轉(zhuǎn)速增高，在離心機沒有溫度控制功能時，離心溫度會逐漸增高，細胞會發(fā)生破壞。如果全血標本常溫儲存較長時間，特別是環(huán)境溫度較高時，細胞同樣發(fā)生破壞，產(chǎn)生肉眼不可見的隱形溶血，釋放多種內(nèi)源性干擾物質(zhì)，干擾檢測結(jié)果。這與楊瑞鋒等[6]研究觀點相一致。另一方面全血標本在不分離狀態(tài)下儲存8 h時，隨著細胞的死亡，釋放一些生物活性物質(zhì)或殘留細胞成分的干擾，均導致檢測結(jié)果假陽性產(chǎn)生，這與趙鴻翔等[7]和譙興強等[8]的觀點相一致。

離心與儲存順序和標本管類型模式對HBsAg檢測結(jié)果的影響無統(tǒng)計學意義，考慮到血漿與血清的主要區(qū)別是血清不含纖維蛋白原，血漿標本留取時抗凝充分，纖維蛋白原沒有析出，未對檢測結(jié)果造成明顯影響。因此，在日常工作中可以替代使用。而離心與儲存順序設(shè)計時儲存溫度在2～8 ℃環(huán)境中4 h，低溫環(huán)境中標本比較穩(wěn)定，在小于4 h的情況下溶血現(xiàn)象不明顯，未對檢測結(jié)果造成明顯影響。

綜上所述，確保HBsAg檢測結(jié)果的準確性，不僅實驗室需要對分析中的各種因素加以控制，還要規(guī)范分析前全血標本的處理流程。雖然一些規(guī)范對標本采集后處理有一定要求，但由于環(huán)節(jié)較多、經(jīng)手人員復雜等原因，對于規(guī)范的執(zhí)行落實情況不到位，從而對標本質(zhì)量產(chǎn)生不可預估的影響。本研究用數(shù)據(jù)驗證了標本處理環(huán)節(jié)中關(guān)鍵控制點，結(jié)果提示：為保證檢測結(jié)果準確性，全血標本采集后應(yīng)立即使用低溫離心機進行分離，否則應(yīng)立即放入2～8 ℃環(huán)境中保存，4 h內(nèi)持續(xù)保持該溫度并使用低溫離心機分離，如果標本發(fā)生明顯溶血，應(yīng)重新留取標本。