人補體因子H相關蛋白在膀胱癌的診斷、病理分級及臨床分期中的應用價值

劉楊，張志平，彭道榮，邢瑞青，李靜，趙媛，劉家云

(空軍軍醫大學第一附屬醫院西京醫院檢驗科，西安 710032)

人補體因子H相關蛋白(human complement factor H-related protein，hCFHrp)是由尿路上皮腫瘤細胞和巨噬細胞產生的，其可打斷補體級聯反應，使人體免疫系統不能很好地識別惡性腫瘤細胞，逃避宿主免疫系統，從而參與腫瘤細胞的發生、發展、侵襲和轉移過程[1-2]。當膀胱發生腫瘤時，膀胱腫瘤細胞分泌的hCFHrp可與基底膜表面相關受體結合，釋放蛋白水解酶水解基底膜，含hCFHrp的基底膜碎片釋放至膀胱內聚合成相對分子質量Mr(×103)為16～165的高分子復合物,即膀胱腫瘤相關抗原(bladder tumor associated antigen，BTA)[3]。hCFHrp是BTA的具體成分，尿液BTA檢測的抗原為補體因子H相關蛋白，故而傳統將補體因子H相關蛋白簡稱為BTA。目前，尿液hCFHrp檢測作為一種無創、便捷且經濟的膀胱癌檢測方法，越來越受到臨床的重視。本文旨在研究尿液hCFHrp在診斷膀胱癌中的應用價值并分析其與患者臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年4月至12月西京醫院泌尿外科收治住院的膀胱癌患者的臨床資料。納入標準：(1)患者首次經膀胱鏡電切除術或手術后送病理活檢確診為膀胱癌。(2)病理結果均由2名病理醫師雙盲閱片確診。(3)患者在行膀胱鏡電切除術或手術等泌尿系統有創檢查前進行尿液hCFHrp檢測，且未接受過任何泌尿系統疾病的治療。(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并有泌尿系統其他惡性腫瘤的患者。(2)合并有泌尿系統結石及腎功能下降的患者。(3)合并有其他部位腫瘤并接受過手術或放、化療的患者。(4)血尿。依據以上標準，共納入膀胱癌患者69例，其中男性45例，女性24例，年齡32～81歲，中位年齡62歲。TNM分期依據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)標準：Ta～T1期35例，T2～T4期34例。病理組織學分級依據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)標準：低分級34例和高分級35例。腫瘤大小依據病理報告，其中腫瘤直徑<1 cm 23例，1～2 cm 26例，>2 cm 20例。回顧性分析同期本院收治的泌尿系統良性疾病患者的臨床資料。納入標準：(1)臨床確診為膀胱炎、膀胱結石、前列腺增生，前列腺炎及泌尿系感染。(2)尿液hCFHrp檢測前未接受過泌尿系統有創檢查。(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并有泌尿系統及其他部位腫瘤患者。(2)腎功能下降患者。(3)血尿。共納入泌尿系統良性疾病患者30例，其中男性19例，女性11例，年齡28～78歲，中位年齡58歲，其中膀胱結石7例，前列腺增生12例，泌尿系統炎癥10例及腺性膀胱炎1例。另選取同期排除有泌尿系統疾病的體檢健康者30例作為健康人對照組，其中男性20例，女性10例，年齡30～77歲，中位年齡59歲。

1.2主要儀器與試劑 Lumo化學發光分析儀(鄭州安圖生物公司)，hCFHrp定量測定試劑盒(微孔板化學發光法，北京普恩光德生物科技公司)。

1.3標本采集 所有研究對象用一次性尿杯留取晨起新鮮中段尿約10 mL，疾病組患者均在泌尿系統有創操作前及臨床治療前留取，尿液以3 000 r/min離心10 min，取上清至塑料試管中，置于-80 ℃凍存備檢。

1.4hCFHrp檢測

1.4.1實驗前準備 將試劑盒從2 ℃～8 ℃冰箱取出，室溫靜置30 min以上平衡至室溫(18 ℃～25 ℃)，20倍濃縮稀釋液用純化水或蒸餾水稀釋20倍后使用。

1.4.2實驗方法

1.4.2.1加樣溫育 取足夠數量的包被板，固定于框架上，分別設置校準品孔、質控品孔、待測樣本孔，記錄各孔位置，按順序在校準品孔中加入校準品50 μL，在質控品孔加入質控品50 μL，在待測樣本孔中加入45 μL hCFHrp樣品稀釋液，按順序在樣本孔中分別加入5 μL的待測樣品，等同于樣本進行了10倍稀釋，20 min內完成此步操作。每孔加入hCFHrp酶工作液50 μL，震蕩混勻，加蓋封板膜，37 ℃溫育60 min。

1.4.2.2洗板 除去孔內液體，在干凈的吸水紙上拍干，每孔加入35 μL洗液，靜置5～10 s后棄盡，重復沖洗5次，最后在干凈的吸水紙上拍干。

1.4.2.3測定 每孔加入50 μL化學發光液A和50 μL化學發光液B，充分混勻后置入Lumo化學發光分析儀檢測并讀數。

1.4.2.4計算 根據校準品的濃度及對應的光子數，均以校準品S0孔調零，使用雙對數線擬合方式[log(X)-log(Y)]計算結果。將質控品對應的光子數帶入標準曲線方程，計算出的結果即為質控品濃度；將樣本對應的光子數帶入標準曲線方程，計算出的結果按公式：C檢測=C計算×10，轉換成樣本的檢測濃度。

1.5統計學分析 采用IBM SPSS Statistics 23統計軟件進行數據分析；計數資料用頻數和率表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料呈偏態分布，數據采用中位數(四分位數)[M(P25,P75)]表示，多組間比較采用Cruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；采用ROC曲線分析尿液hCFHrp對膀胱癌診斷的特異性、敏感性和cut-off值。

2 結果

2.1不同人群尿液hCFHrp濃度及陽性率的比較 膀胱癌組、良性疾病組及健康人對照組尿液hCFHrp濃度逐漸下降[182.37(90.14～584.22) U/mL，53.70(32.48～84.08) U/mL，20.7(9.10～34.30) U/mL]，差異有統計學意義(H=73.17，P<0.001)。進一步進行組間兩兩比較，結果發現膀胱癌組hCFHrp水平高于良性病變組(U=322.0，P<0.01)及健康人對照組(U=152.0，P<0.01)，而良性病變組hCFHrp水平高于健康人對照組(U=215.0，P<0.01)；此外，比較各組hCFHrp陽性率(取臨界值89.03 U/mL)，3組間差異有統計學意義(χ2=60.14，P<0.001)，進一步進行組間兩兩比較，發現膀胱癌組陽性率為76.81%，顯著高于良性病變組20.00%(χ2=28.06，P<0.001)及健康人對照組0.00%(χ2=49.59，P<0.001)，而良性病變組陽性率顯著高于健康人對照組(χ2=6.67，P=0.024)，差異均有統計學意義。

2.2尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數的關系 高級別組膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率(取臨界值89.03 U/mL)較低級別組顯著升高，差異有統計學意義；T2～T4期的膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率較T0～T1期患者顯著升高，差異有統計學意義；膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率隨著腫瘤體積的增大呈上升趨勢，差異亦有統計學意義。見表2。

表2 尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數的關系

2.3尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線分析 以膀胱癌患者為疾病組，泌尿系良性疾病患者及健康人為對照組，繪制ROC曲線。結果顯示，尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.922，當cut-off值為89.03 U/mL時，其敏感性為76.80%，特異性為95.00%，約登指數為0.718。見圖1。

圖1 尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討論

膀胱癌是我國泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其具有惡性程度高，復發轉移率高，預后差等特點[4]。傳統的針對膀胱癌的診斷檢查有腹部膀胱彩超、靜脈尿路造影、 尿脫落細胞學檢查及膀胱鏡檢查，但這些方法在靈敏度和可行性上均存在一定的弊端[5-6]。因此，近些年來針對膀胱癌的分子生物學診斷技術越來越受到關注。

目前，美國食品與藥物委員會(FDA)己批準將hCFHrp等多項生物學標志物用于膀胱腫瘤的檢查[7]，本研究通過微孔板化學發光法對不同人群的尿液hCFHrp含量進行檢測，結果顯示尿液hCFHrp含量在膀胱癌患者中顯著升高，hCFHrp診斷膀胱癌的特異性較高，敏感性適中。朱有森等[8]和熊雄等[9]報道的尿液hCFHrp診斷膀胱癌的敏感性和特異性分別為72.3%和 89.6%以及85.96%和82.29%，與本研究結果比較存在較大差異，分析原因可能與本研究在選擇膀胱癌患者入組時，嚴格排除了具有對尿液hCFHrp水平存在潛在影響因素的患者有關，如嚴重血尿，尿路感染，尿路結石等[10]，還可能與各項研究所收集的病例數量、腫瘤類型以及患者的尿液性狀不同有關。hCFHrp是尿路上皮惡變時水解基底膜產生的基底膜碎片，但許多泌尿系統良性疾病也常會發生尿路移行上皮細胞破壞而致的基底膜破壞，從而導致尿液hCFHrp假陽性結果。因此，臨床對hCFHrp檢測結果的判定應綜合hCFHrp潛在影響因素、患者的臨床特征以及其他檢測指標共同進行，尿液hCFHrp檢測在膀胱癌的診斷上仍不能取代膀胱鏡檢及病理組織活檢。本研究進一步分析了尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數的關系，結果顯示膀胱癌患者尿液hCFHrp濃度隨著腫瘤向高級、高期進展而呈上升趨勢，且與腫瘤大小有一定的相關性，這與文獻報道一致[6，11-12]，表明尿液hCFHrp檢測對臨床判斷腫瘤的惡性程度及疾病進程具有一定的價值，但本研究對缺少尿液hCFHrp對膀胱癌的預后評估。研究顯示，不同尿液hCFHrp表達水平的膀胱癌患者，其 3年生存情況不同，hCFHrp 陽性患者3年生存率顯著低于陰性患者，提示尿液hCFHrp 水平可作為膀胱尿路上皮癌患者預后評估的參考依據[8]。

本研究將血尿等因素作為患者納入的排除標準，避免了因血尿等潛在干擾因素造成的假陽性結果，但臨床上膀胱癌患者及泌尿系統良性疾病患者時常合并血尿，因此，尿液hCFHrp檢測在臨床應用中具有一定的局限性。本研究將進一步選擇更接近臨床實際工作中的樣本，驗證尿液中的血紅蛋白、膽紅素、清蛋白及尿酸等對尿液hCFHrp檢測的影響程度，并通過選擇不同的腫瘤標志物與尿液hCFHrp聯合檢測，以提高對膀胱癌診斷的準確性。