外泌體分子標志物檢驗技術進展及臨床應用*

王君怡，李榮，許文榮，江佳佳

(1.江蘇大學附屬澳洋醫院澳洋腫瘤研究院，江蘇張家港215600；2.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013)

外泌體是由細胞內多囊泡體通過膜內陷包裹內容物并與細胞膜融合后被釋放到胞外的一類微小囊泡[1]，在血液、尿液、腦脊液、唾液、母乳、羊水、淋巴液和膽汁等多種體液中均可檢出外泌體[2]。外泌體包裹蛋白質、脂質、核酸及代謝物等生物活性物質，參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等過程[1]。近年來，外泌體高通量組學篩選與分析檢測技術已取得明顯進展，外泌體分子標志物的檢驗及應用實現新的突破。為此，本文將討論不同來源的外泌體分子標志物的檢測方法及其應用價值。

1 外泌體提取

1.1體液樣本采集與預處理 血液外泌體提取通常采用血清或血漿樣本。血清樣本用于外泌體微小RNA檢測，EDTA抗凝血漿常用于外泌體RNA分析。EDTA抗凝血室溫以2 500×g離心15 min去除血小板，收集上層血漿再次離心后即可獲得。

尿液具有無創、簡便、量大等優勢，尿液外泌體miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p和前列腺特異抗原組合可顯著提高前列腺癌診斷效率[3]。尿液收集后通常需加入蛋白酶抑制劑以防外泌體表面蛋白分子降解，再以4 ℃、3 000×g離心15 min即可。

腦脊液外泌體miRNA-9-5p和miRNA-598可作為阿爾茲海默癥的潛在生物標志物[4]。腰椎穿刺或術中采集腦脊液時應避免穿刺損傷帶來的血液污染。所獲樣本以4 ℃、3 000×g離心15 min。

唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA可作為食管鱗狀細胞癌的早期診斷標志物[5]。唾液具有非侵襲性、易收集、依從性高等優勢。但唾液黏性高，樣本應進行超聲或過濾，再以4 ℃、3 000×g離心20 min去除雜質。

為保證外泌體的純度和生物活性，腦脊液、血液樣本應在采集后1 h內，尿液和唾液樣本則在采集后2 h內進行預處理。若長期儲存，應分裝凍存于-80 ℃，避免反復凍融。

1.2外泌體分離與純化 外泌體有效分離是外泌體分子標志物檢測的關鍵。依據其物理、化學和生物學特性已建立了多種分離方法,各有利弊，應根據樣本來源、檢測目的與預算成本等實際情況進行選擇(表1)。

表1 常用外泌體分離技術

超速離心法是基于外泌體尺寸差異采用不同相對離心力提取外泌體的經典方法[6]。該法技術成熟但耗時長，適用于大體積樣本。

密度梯度離心法是依據樣本中不同組分的沉降系數分離外泌體，按照介質可分為蔗糖密度梯度離心法和碘克沙醇密度梯度離心法[6]。

超濾法利用超濾膜孔徑大小對不同分子質量的物質進行分離，通常選用相對分子截留量為100 kDa的超濾管，提取外泌體的同時能夠濃縮樣本量[6]，可有效減少因超高速離心對外泌體的損壞。

聚合物沉淀法是利用聚合物作為沉淀劑從樣本中分離沉降出外泌體，其中聚乙二醇(PEG)是最常用的沉淀試劑。樣本在4 ℃經PEG處理后過濾或離心即可沉淀、回收外泌體，但夾雜的大量脂蛋白和RNA可能影響后續分析?，F已基于該方法開發出眾多商品化外泌體提取試劑盒。

免疫磁珠法利用包裹單克隆抗體的磁珠捕獲外泌體表面特異性分子進行外泌體提取，可確保外泌體的特異性和完整性并能進一步分離不同外泌體亞群，但其只能提取高表達靶抗體的外泌體[6]。

尺寸排阻色譜法以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質，基于尺寸差異分離外泌體。操作時需考慮凝膠顆粒的孔徑、外泌體與介質間的相互作用、混合液中各物質分子量差異等因素以提高分離效率[7]。

微流控技術是基于微流控芯片實現各種微粒分離與檢測的新技術，又被稱為“芯片實驗室”。近年來，研究者在微流控技術的基礎上結合納米聲學過濾器、粘彈性流體分選、側向位移和免疫親和等技術[8]開發出多種低成本、高效率、高通量的新型外泌體分離方法。Wang等[9]將聲學和微流體技術融合，使用微小的聲流芯片分析唾液樣本，5 min內實現對唾液外泌體的自動分離。Xu等[8]建立了一種集分離、富集和檢測為一體的肝癌相關外泌體分析平臺，該芯片由1個Y型微柱陣列組成的捕獲區和級聯的ITO電極構成，將特異性磷脂酰絲氨酸Tim4蛋白識別的磁富集技術與信號轉導技術結合，僅需4 h即可從30 μL血液樣本中分離出肝癌來源外泌體，并進行后續分析。

場流分離是在垂直于樣品流的上方施加流體場，以便基于樣品尺寸、質量、密度、體積等理化性質進行物質分離[10]。目前應用最廣泛的場流分離技術是非對稱流場流分離。樣本在交叉流力場和擴散力的雙重作用下，根據流體動力學的尺寸差異分布于交叉流截面不同高度，隨后在縱向流載液的推動下分離外泌體，并能進一步鑒定外泌體亞群[10]。該法可從小鼠黑色素瘤細胞系成功分離出外泌體，并可聯用紫外檢測器、多角度激光散射檢測器等技術進行分析與表征[11]。

1.3外泌體鑒定 外泌體鑒定主要包括形態、大小和表面標記蛋白質。通過掃描電鏡和透射電鏡等可直接觀察外泌體形態與結構，典型形態呈酒杯狀。納米顆粒跟蹤分析和動態光散射計算獲得外泌體粒徑與濃度，多集中于30～150 nm。western blot檢測CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70、ALIX等外泌體標志蛋白質。此外，流式細胞儀可通過特異性標記抗體或特殊染料快速、高通量地篩選和分析外泌體。

2 外泌體分子標志物分析技術與臨床應用

外泌體攜帶大量特異性蛋白質、脂質、核酸和代謝物等，它們與多種疾病的發生、發展密切相關，分析外泌體中特異性分子的表達水平對疾病診療有重要意義。

2.1蛋白質類標志物 外泌體蛋白質水平的分析技術主要有蛋白免疫印跡、ELISA、納米流式細胞術、免疫電鏡、串聯質譜法等，其中免疫印跡法和ELISA最為常用，但許多低豐度的蛋白質無法檢出。質譜分析逐漸成為外泌體蛋白質組學檢測的重要技術。Xie等[12]利用TMT蛋白質組學技術篩選并驗證，結果發現血清外泌體ITGβ3的表達水平與骨密度成正相關(r=0.304,P=0.009)，有助于老年骨質疏松癥的診斷和治療。Hoshino等[13]使用液相色譜-串聯質譜法對源于16種不同腫瘤的120份血漿外泌體樣品進行蛋白質組學分析，篩選出相關蛋白質組合應用于疾病診斷和腫瘤類型預測，對原發性未知腫瘤的分類可達到95%敏感性和90%特異性。以上研究表明外泌體蛋白可作為疾病診斷及預后的潛在生物標志物。

2.2脂質類標志物 外泌體脂質檢測方法以質譜分析為主。Skotland等[14]采用高通量質譜定量分析方法發現前列腺癌患者尿液外泌體中有9種脂質的表達水平顯著升高，其中磷脂酰絲氨酸和乳糖基神經酰胺檢測的敏感性為93%，特異性為100%。最近，有學者利用靶向-非靶向串聯質譜評估發現，COVID-19患者血漿外泌體中單唾液酸二己糖神經節苷脂含量與COVID-19的嚴重程度呈顯著正相關(P=0.003 7)，有望成為COVID-19新型檢測指標[15]。

2.3代謝物標志物 外泌體中小分子代謝物逐漸被關注。研究者通過靶向超高效液相色譜-串聯質譜技術發現尿液外泌體中葡萄糖醛酸、D-核糖-5-磷酸和異丁?；?L-肉堿等代謝指標對前列腺癌的診斷及預后具有一定指導作用[16]。Luo等[17]研發了一種攜帶電噴霧離子源的納流液相色譜-質譜分析平臺，可定量檢測和分析血漿外泌體中的痕量代謝物。

2.4核酸類標志物 外泌體標志物研究主要集中于非編碼RNA，相關技術包括高通量的基因芯片和二代測序技術，可實現外泌體非編碼RNA表達譜分析，大力推動了低豐度LncRNA和circRNA的研究。

2.4.1qRT-PCR技術 該技術廣泛應用于外泌體RNA的檢測。Sun等[18]結合exoRBase數據庫和qRT-RCR技術發現聯合檢測hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123和hsa_circ_0075792可明顯提高原發性肝癌的診斷敏感性(90.5%)和特異性(78.1%)。Ji等[19]采用qRT-PCR技術篩選出的血清外泌體miR-374a-5p可作為高靈敏度、高穩定性的早期胃癌診斷標志物，ROC曲線下面積為0.919。

2.4.2數字PCR 該技術是一種核酸分子絕對定量技術，無需標準曲線，對LncRNA和circRNA也能實現高精度的靶標定量[20]，有效彌補qRT-PCR技術靈敏度不夠、步驟繁瑣及假陽性率高等問題(表2)。Hu等[21]采用液滴數字PCR技術發現聯合分析circGSK3β和癌胚抗原可顯著提高食管鱗狀細胞癌早期診斷敏感性(87.5%)。Bai等[20]開發了一種多色熒光數字PCR EV-LncRNA，可簡單、快速、高通量分析肺癌血液外泌體LncRNA的表達。另外，Yoshizawa等[22]使用3D數字PCR技術發現早期胰腺導管腺癌患者尿液外泌體中miR-3940-5p/miR-8069比值顯著升高，與CA19-9聯合檢測時其敏感性和陽性預測值分別提高至93%和78.4%。

表2 核酸分子分析新技術

2.4.3目前正在逐步開發應用更靈敏的自動化外泌體核酸分析技術 He等[23]基于全內反射熒光成像原理開發了一種單囊泡成像分析方法，該法將分裂式DNA酶和熒光淬滅底物共同包裝至外泌體，產生靶向miRNA的催化裂解反應和放大的熒光信號，從而直接觀察血清外泌體并對其包裹的miRNA進行原位定量和分析。Wu等[24]根據表面等離子體共振成像(SPRi)原理設計出一種新型生物傳感器，通過Au-on-Ag異質結構和新型DNA納米材料之間的協同作用超靈敏地檢測出非小細胞肺癌相關外泌體miRNA，可用于早期診斷。Yang等[25]將等離子體共振瑞利散射光譜法和暗場顯微鏡融合，開發了一款新型集成微流控裝置，能從非小細胞肺癌患者尿液中分離并檢測相關外泌體，發現早期肺癌患者。

3 外泌體分子標志物常用生物信息學技術

隨著高通量檢測手段的發展和外泌體分子標志物研究的深入，現已建立多種外泌體相關數據庫以供查閱(表3)。

表3 外泌體分子標志物常用數據庫

exoRBase數據庫是目前最為齊全的外泌體內容物數據庫，囊括了92個血樣RNA-seq實驗數據，覆蓋多種疾病，主要為血液外泌體中的circRNA、LncRNA和mRNA。

EVpedia數據庫收集了原核生物、非哺乳類真核生物和哺乳動物囊泡的高通量分析數據，并提供相關分析工具，操作方便、實用性強。

ExoCarta數據庫是首個外泌體標志物綜合數據庫，覆蓋多物種、多組織器官外泌體內容物數據，并附加外泌體蛋白互作網絡和相關生物學信息以供檢索。

此外，還有Vesiclepedia數據庫、EVmiRNA數據庫、EVLncRNA2.0數據庫、外泌體circRNA數據庫、Urinary Exosome Protein Database數據庫、exRNA Atlas數據庫、miRandola數據庫等，可根據實際需求聯合使用。

4 小結及展望

體液中外泌體體積小、分布廣、含量高，其脂質膜結構能有效保護內容物不受體液中各種酶類干擾[26]，幾乎所有類型的細胞均能分泌外泌體，因此，外泌體標志物的檢測為慢性病和惡性疾病的早期診斷和精準治療帶來新的希望。近年來涌現出多種新型外泌體分離方法如微流控技術和非對稱流場流分離技術，可實現外泌體高效率、高純度的富集。基于生物傳感器、質譜分析、SPRi和數字PCR等新型檢測技術也被逐漸應用。然而現階段外泌體分子標志物檢測應用仍受到一些限制，例如大量的臨床數據如生存時間、預后狀況、病理相關性分析不夠完備；缺乏足夠的臨床樣本支撐和嚴格的方法學評價；缺少足夠靈敏且快速的檢測方法，外泌體分子標志物一體化檢測平臺有待開發。

外泌體分子標志物的研究也推動了外泌體靶向治療的發展，天然或工程化修飾的外泌體被視為惡性疾病精準治療的一種理想工具。例如外泌體作為靶向Kras G12D的給藥載體可明顯緩解小鼠胰腺癌的進程[27]；具有靶向修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)的外泌體是2型糖尿病治療的潛在藥物載體[28]。因此，鑒于外泌體分子標志物檢測方法的不斷完善，其臨床應用會顯示出在疾病預防、診療及康養中的重要價值。