分子診斷技術在新型冠狀病毒核酸檢測中的應用及發展*

陳馨寧，黃斐，張春燕，潘柏申

(1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海200032；2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，福建廈門 361015)

截至2021年5月，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引發的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)已經累及185個國家，全球累計確診人數超過1.6億。SARS-CoV-2主要傳播途徑是經呼吸道飛沫和密切接觸傳播[1]。SARS-CoV-2在不同感染者間的臨床表現存在較大個體差異，從無癥狀到常見的發熱、干咳、乏力甚至嚴重急性呼吸綜合征等[2]。其中，無癥狀感染者成為SARS-CoV-2傳播和疫情反彈的焦點[3]。這突顯了大規模提供準確、有效地診斷檢測以識別感染者的重要性。

SARS-CoV-2實驗室檢測包括：(1)核酸檢測，即診斷病原體感染的“金標準”，是確診、治療和防控COVID-19的主要手段；(2)血清學檢測，即檢測機體產生新冠病毒特異性抗體，但由于存在“窗口期”，不適合用于早期診斷；(3)病毒分離培養與鑒定，即病原學鑒定的傳統金標準，受限于耗時和實驗室安全等級要求，暫不作為日常診斷方法。本文將結合SARS-CoV-2核酸檢測現狀，著重概述不同分子診斷技術，并對上述技術在未來傳染病暴發中的應用和發展提出建議。文中所涉及的新冠相關內容僅依據現行標準指南，實際操作時還應遵循最新版本。

1 核酸檢測樣本

1.1樣本類型 根據《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》中附件10《新冠病毒樣本采集和檢測技術指南》，需由經過生物安全培訓合格和具備相應實驗技能的人員進行樣本采集，無癥狀患者和普通人群篩查優先采集鼻咽拭子，次之為口咽拭子；急性期患者應采集呼吸道標本；重癥患者優先采集下呼吸道標本(表1)[4-5]。另需注意多部位(類型)樣本聯合檢測能有效防止由樣本造成的假性結果。

表1 新型冠狀病毒核酸檢測樣本[6-9]

1.2采樣模式 考慮到檢測壓力和衛生經濟資源壓力，國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯防聯控機制醫療救治組于2020年7月21日和8月17日相繼制定了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測技術指引》和《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術規范》，以供特定人群(總體陽性率低于0.1%)針對混合樣本進行核酸檢測(低風險地區可按照10∶1、中風險地區可按照5∶1的檢測模式)。值得注意的是，混合樣本在臨床檢測中存在風險，如無法通過內參監控樣本質量、混合樣本復雜性和異質性。對于重點區域人群及醫療機構就診患者檢測，還是應當單采單檢[10-12]。

2 核酸檢測技術

SARS-CoV-2是一種正義單鏈RNA病毒(Genbank：MN908947)，其基因組全長為29 903個核苷酸，轉錄29種蛋白質。其中，開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)基因編碼16個非結構蛋白質，結構基因組依次編碼棘突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)(圖1)[13]。根據《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)》，高度特異的ORF1ab基因和相對保守的N基因是SARS-CoV-2核酸檢測的推薦靶點[14]。SARS-CoV-2具有基因組校對機制，可以防止病毒積累可能削弱自身的突變[15]。但隨著時間推移和人際傳播，自然選擇仍然可以對罕見但有利于病毒的突變起到作用，獲得具有適應度優勢和免疫抗性的突變[16]。

圖1 SARS-CoV-2結構示意圖

自疫情暴發以來，全球各地不同科學背景的研究人員和整個體外診斷(in vitro diagnostics，IVD)領域致力于技術攻關，將科研成果落地轉化，以滿足一線防控診治對快速準確診斷檢測的需求。國家藥品監督管理局(National Medicine Products Administration，NMPA)批準及獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)緊急使用權的核酸檢測試劑中，可以發現目前SARS-CoV-2核酸檢測所使用的分子診斷技術原理各不相同，提供了全場景化核酸檢測方案。

2.1常態化防控

2.1.1常規檢測 醫院檢驗科、疾控中心和第三方檢測機構承擔了大范圍篩查的工作，確保了“應檢盡檢、愿檢盡檢”的有序開展，適合本次大面積流行的新冠肺炎疫情。通過提供規?；图s化的檢測服務，滿足常規檢測的需求，為臨床提供及時精準的信息，繼而達到提高人民健康水平服務這一目標[17]。

截至2021年2月10日，經NMPA審批批準26個新冠病毒核酸檢測試劑中(圖2)，不難發現逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-PCR，RT-PCR)技術憑借至少達10拷貝/反應的靈敏度和96個樣本/批的檢測通量成為目前臨床上主流應用于SARS-CoV-2核酸檢測的方法。RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸過程中將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行跟蹤并進行產物分析[18]。除了常見的以ORF1ab和N基因為靶點的RT-PCR檢測外，同時也存在針對E基因的臨床檢測。單靶、雙靶、三靶的檢測及不同判讀標準對實驗人員的專業素質提出要求[19]，需執PCR證上崗人員在PCR認證實驗室開展。

圖2 NMPA獲批試劑盒檢測原理圖

此外，對已知的多種病原體核酸同時進行意向性篩查也是一大臨床需求，即在識別SARS-CoV-2的同時，排查其他引起相似癥狀的病毒?；蛐酒ㄟ^微陣列技術，應用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進行大規模集成的固相雜交檢測DNA[20]。雙擴增法利用特異探針和標記有多生物素的放大探針雜交，實現病原體靶核酸的信號放大[21]。同時，已有一些企業基于核酸質譜技術開發了呼吸道病原體多重檢測試劑盒，樣品經過多重PCR擴增后，用特異性的質量探針進行延伸反應，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)檢測分子量的差異[22-23]。但核酸質譜對環境設備和人員資質具有一定要求，在檢驗科中難以普及，但在醫學獨立實驗室中可以展露鋒芒。

以上技術迎合了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第八版)》中對全面鑒別診斷新型冠狀病毒感染提出的要求，一次檢出包括SARS-CoV-2在內的多種臨床常見呼吸道病原體。有效區分健康人群、新冠病毒感染者與其他呼吸道感染患者，實現對就診人群的快速檢測和準確分類，從而大幅度降低疑似病例數量、降低醫患風險、助力疫情防控。

2.1.2快速檢測 快速檢測是新冠肺炎常規化防控的前哨。床旁檢驗(point-of-care testing，POCT)中的分子診斷技術突破了專業實驗室的限制，實現去中心化，將應用場景拓展到出入境、機場、火車站、基層醫療單位等。最大化分子診斷檢測效益，解除了核酸檢測對人員、儀器、場地的依賴性，改善了周轉周期的問題，迎合了對快速報告的需求[24]。

其中，等溫擴增(isothermal amplification technology，IAT)技術在恒定的溫度下，通過添加不同酶和特異性引物進行快速核酸擴增。單一溫度對儀器要求低。目前主要的恒溫擴增技術有：滾環核酸擴增(rolling circle amplification，RCA)、環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、鏈替代擴增(strand displacement amplification，SDA)和依賴核酸序列擴增(nucleicacid sequence based amplification，NASBA)等(表2)[25-27]。目前已經有基于此技術的POCT類商品化試劑盒，但尚無大量臨床驗證及應用。而且由于該技術對引物設計復雜，可能存在假陰性和假陽性干擾[28]。

表2 基于等溫擴增技術的病毒核酸檢測對比

此外，基因編輯技術為基礎的核酸檢測也具有廣闊發展前景。基因編輯技術是以規則成簇間隔短回文重復序列及其相關蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas)系統為代表，利用RNA引導Cas核酸酶，對基因及轉錄產物進行定點修飾編輯[29-30]。2020年5月，張鋒團隊提出的STOPCovid.v2(SHERLOCK testing in a one pot)技術是聯合RNA提取、LAMP和CRISPR介導的集大成者，對SARS-CoV-2檢出達到93.1%的靈敏度和98.5%的特異性，陽性樣本只需 15～45 min就能獲得結果且結果可視化[31-32]。

除以上主流POCT方法外，另有部分獲FDA或NMPA批準的檢測技術，雖然缺少文獻報道但仍有一定應用前景。例如，雜交捕獲免疫熒光分析法是將核酸雜交技術和免疫熒光捕獲技術相結合的方法。通過試劑直接裂解病原體并釋放靶核酸，利用熒光粒子對雜交體進行熒光信號識別，實現對樣本中新冠病毒的特異性靶基因的定性判斷[33]。RNA捕獲探針法是用特異性靶標捕獲法磁珠提取病毒RNA再結合轉錄介導的恒溫擴增結合的實時檢測技術[34-35]。兩種方法同樣兼具檢測設備體積小和單個樣本檢測時長短的優勢，且兩種方法試劑商宣稱的檢測靈敏度、特異性都能夠達到傳統PCR方法的水平。

2.2病毒溯源及變異監測 病毒溯源和變異監測是疫情防控的“必答題”。第一時間獲取全部病毒基因信息，可以解釋病毒的來源、傳播、變異演化等科學問題、指明后續流行病學調查方向、助力病毒變異監測。

得益于高通量測序(next generation sequencing，NGS)技術在疫情初期，僅5 d的時間內獲得了SARS-CoV-2基因組序列，為進行溯源工作和全世界抗擊病毒奠定了基礎[36]。NGS主要是對臨床樣本中提取的核酸進行大規模平行測序，再經過數據庫比對與生物信息學分析，完成包括病毒在內的多種病原體檢測[37]?；贜GS的核酸檢測包括宏基因組測序、探針捕獲測序和擴增子測序(表3)[38]。檢測周期長、操作流程復雜、對生物信息學專業背景要求等限制使NGS難以成為臨床一線開展核酸檢測方法。

表3 基于NGS技術的病毒核酸檢測對比

目前，全球各地已檢測出各種變異SARS-CoV-2，依賴于NGS技術，各方也在開展相關病毒株變異監測工作[39]，及時評估防疫措施，確保各環節預防效果。通常，病毒以每月大約1～2個堿基突變的速度積累突變。這意味著今天測序的許多基因組與2020年1月最早測序的基因組相差約20個位點。針對SARS-CoV-2突變株的研究認為[40]，突變株在S蛋白(尤其RBD區域)上發生的突變不會影響以ORFlab、N、E基因為靶點的核酸檢測試劑的檢測能力。但新發突變株B.1.1.7中發現的69/70缺失突變已被證實會影響針對S基因的聚合酶鏈反應檢測的性能[41-42]。

2.3參考品制作 各實驗室、地區、國家之間的SARS-CoV-2核酸測量結果都需要通過一致性計劃并進行準確性工作。數字PCR(digital PCR，dPCR)技術將反應混合物分割成上千至上萬個不等的液滴，讀取每一獨立反應單元的擴增情況，利用泊松分布，實現模板DNA的絕對定量。檢測原理加之其獨立于校準曲線的特性使其具備高檢測靈敏度(2.5個拷貝/反應)及抗干擾能力，使其可以被利用于SARS-CoV-2核酸檢測參考品制備。此外，多項獨立研究表明，SARS-CoV-2核酸檢測性能大大優于RT-PCR[43-44]。帶來檢測性能提升的同時，也增加了操作和成本的負擔。因此，dPCR技術應用更偏向于動態監測病毒載量和環境監測(如公共場所、病房、衛生間、實驗室手套、廢水等)等[45]。

以上提到的所有核酸檢測技術，都可作為標準RT-PCR方法的補充，互為驗證。尤其對于“灰區”患者復檢、疑似患者排查和感染初期病毒載量低的患者，應更為謹慎。除了多技術檢測的核酸結果外，IgM/IgG抗體結果、影像學、流行病學史和臨床表現等都有所幫助，應根據實際情況選擇使用。

3 小結及展望

盡管COVID-19疫情尚未戰勝，但本次疫情中分子診斷技術的角色和效用可以作為未來傳染病暴發中的范例。檢測能力的提升對于控制疫情必不可少，質量控制和技術創新密不可分。

核酸檢測的可靠性和有效性是第一優先級。實驗室應不斷加強自身能力建設、對不同廠家試劑進行嚴格性能驗證與比對、做好日常室內質控，并常態化接受國家級或省級檢驗質量控制以助力患者的臨床管理。各省級衛生健康行政部門要加強對核酸檢測實驗室的日常質量控制工作，組織實驗室參加室間質評并對實驗質評結果進行及時地回顧、反饋及干預。進一步提高核酸檢測質量，從而降低臨床假陰性風險、有效控制病毒傳播[46-47]。實驗室人員和試劑研發人員應時刻關注突變株對病原體核酸檢測的影響。通過對照公開的病毒基因組序列數據庫定期評估和修正引物集及檢測體系，以保證檢測有效性?？茖W家們應對研發更快、更便捷、更準確、更安全的核酸檢測迭代技術和搭建POCT平臺保持熱度，適應疫情偶發和常態化的現實狀況，滿足防控要求。

COVID-19疫情引發了對分子診斷技術的開發和投資。在此次寶貴經驗的基礎上，臨床醫生、科學家和公共衛生管理人員之間的多學科合作無疑可以實現向其他病原體疾病的拓展。

利益沖突：作者聲明無任何利益沖突