血清miR-211對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷價(jià)值及其影響因素分析

劉琪，王紹飛，丁琳，秦艷莉，麥迪娜·那畢江

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院眼科,烏魯木齊 830001)

2型糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝性疾病，糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是其常見的并發(fā)癥之一，屬于嚴(yán)重的全身微血管并發(fā)癥[1]。早期研究多認(rèn)為，DR的發(fā)病機(jī)制與血管內(nèi)皮功能損傷、糖基化末端產(chǎn)物及高糖應(yīng)激損傷等機(jī)制有一定的關(guān)系[2]。近年來研究顯示，微小RNA(miRNA)參與了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過程，且在血管病變中起到關(guān)鍵性作用，并進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信號(hào)通路的傳導(dǎo)過程產(chǎn)生影響[3]。有學(xué)者證實(shí)，miR-211在糖尿病及眼部并發(fā)癥進(jìn)展過程中具有重要作用，高糖環(huán)境下其表達(dá)水平會(huì)顯著增加[4]，但是其表達(dá)水平對(duì)DR影響的機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在檢測并評(píng)估血清miR-211對(duì)DR的診斷價(jià)值，并對(duì)其影響因素進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年12月至2020年10月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院眼科收治的DR患者90例作為DR組，男46例，女44例，年齡(65.93±9.92)歲，并進(jìn)一步分為增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR，n=31)和非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR，n=59)。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性2型糖尿病且病程不低于2年；所有患者均符合2014版DR臨床診療指南標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于DR的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，未接受抗DR的相關(guān)治療；屈光介質(zhì)及眼壓正常；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期有創(chuàng)傷史及手術(shù)史；伴有全身惡性腫瘤、肝腎功能障礙及心腦血管嚴(yán)重病變患者；伴有青光眼、白內(nèi)障、視神經(jīng)疾病及視網(wǎng)膜靜脈阻塞等其他眼部疾病患者；患有糖尿病的其他并發(fā)癥患者；伴有急性或慢性感染患者；伴有甲狀腺功能亢進(jìn)及庫欣綜合征等對(duì)糖代謝造成影響的疾病患者；伴有自身免疫系統(tǒng)疾病患者；長期使用抗精神疾病類藥物或糖皮質(zhì)激素類藥物患者；哺乳期或妊娠期婦女；無法配合眼科檢查患者；臨床資料不完善患者。選擇本院同期收治的單純2型糖尿病患者(未合并DR)45例作為NDR組，均符合中國2型糖尿病防治指南中2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，男21例，女25例，年齡(65.89±9.87)歲。另選同期在本院進(jìn)行體檢的健康受試者45例作為健康人對(duì)照組，男23例，女23例，年齡(66.01±10.22)歲。各組受試者的基本資料見表1。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：LY-2018-03)，受試者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器 VEGF雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國R&D公司)，DEPC水(天根生化科技公司)，Trizol LS試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)，氯仿、乙酸、乙醇(中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，RNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)，二甲亞砜(DMSO，美國Sigma-Aldrich公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。低溫、低速離心機(jī)(德國Heracus公司)，超低溫冰箱(日本Sanyo公司)，紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)，CFX96型熒光量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集所有受試者入組時(shí)(體檢健康者于體檢時(shí)采集)及餐后2 h空腹肘靜脈血4 mL于非抗凝采血管中，室溫靜置30 min，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，取上清液500 μL分裝于1.5 mL無菌Eppendorf管中，置于-80 ℃保存。另采集各組空腹外周靜脈血3 mL于非抗凝采血管中，5 000 r/min離心5 min后取上清備用。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 取上述各組的血清標(biāo)本500 μL，按照Trizol LS試劑說明書提取總RNA，并根據(jù)RNA純化試劑盒說明書對(duì)RNA進(jìn)行純化，采用紫外分光光度計(jì)檢測其吸光度(A260/280 nm)，取比值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，并置于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-211及U6引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工公司完成。 miR-211上游引物序列：5′-TCGGCAGGTCCCTTTGTCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 PCR總反應(yīng)體系為25.0 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ExTaq酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min ；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸10 min， 28～36個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。采用CFX96型熒光定量PCR儀配套軟件于61 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，以U6為內(nèi)參照，采用=2-△△Ct法計(jì)算miR-211的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.3.3VEGF水平測定 取上述各組上清標(biāo)本50 μL，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中VEGF的表達(dá)水平，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作及結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.13組受試者臨床資料比較 3組受試者的年齡和性別等基本資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但空腹血糖、糖化血紅蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間兩兩比較結(jié)果表明，DR組和NDR組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白的表達(dá)水平均顯著高于健康人對(duì)照組(P<0.05)，且DR組亦高于NDR組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 3組受試者臨床資料比較結(jié)果

2.23組受試者血清VEGF水平及血漿中miR-211表達(dá)量的比較 3組受試者血清VEGF水平及miR-211相對(duì)表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較結(jié)果表明，NDR組和DR組患者血清VEGF水平和miR-211的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于健康人對(duì)照組，且DR組高于NDR組(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清VEGF水平及miR-211相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3不同分期DR患者血糖指標(biāo)、血清VEGF水平及miR-211相對(duì)表達(dá)量比較 PDR組患者血清VEGF水平、miR-211相對(duì)表達(dá)量、糖化血紅蛋白和空腹血糖水平均顯著高于NPDR組(P<0.05)。見表3。

表3 不同分期DR患者血糖指標(biāo)、血清VEGF水平及miR-211相對(duì)表達(dá)量比較

2.4DR患者血漿miR-211相對(duì)表達(dá)量的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，性別和年齡不是DR患者血漿miR-211相對(duì)表達(dá)量的影響因素；但DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程均是DR患者血漿中miR-211相對(duì)表達(dá)量的影響因素。見表4。

表4 DR患者血漿中miR-211相對(duì)表達(dá)量的影響因素分析

2.5DR患者血漿miR-211相對(duì)表達(dá)量與糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DR患者糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平與miR-211的相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)(r值分別為0.879、0.763、0.775，P均<0.001)。

2.6ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-211診斷DR的效能 采用ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-211對(duì)DR的診斷效能，將DR組賦值1，NDR組和健康人對(duì)照組賦值0，結(jié)果顯示， miR-211診斷DR的ROC曲線下面積(AUCROC)及95%CI分別為0.839(95%CI:0.785～0.894，P<0.001)，當(dāng)cut-off值為2.23時(shí)，其敏感性和特異性分別為72.4%和75.0%。

3 討論

DR作為糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是損害視功能甚至造成失明的重要原因，DR的發(fā)生、發(fā)展過程與miRNA及VEGF基因的調(diào)控關(guān)系密切[7]。miRNA可以特異性作用于靶基因序列，在轉(zhuǎn)錄水平后對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[8]。血液循環(huán)中的miRNA是理想的生物學(xué)標(biāo)志物之一，具有穩(wěn)定性高、靈敏度高、易獲取及非入侵性等特點(diǎn)，其表達(dá)水平的異常改變較其所調(diào)控的蛋白質(zhì)表達(dá)改變時(shí)間上更早，在糖尿病患者尚未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變時(shí)其表達(dá)水平已出現(xiàn)異常[9]。研究證實(shí)，miRNA在心臟病及糖尿病腎病等糖尿病血管并發(fā)癥中可反映病變組織的病理變化，是有效的生物學(xué)標(biāo)志物[9]。DR進(jìn)展過程中造成的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷可使細(xì)胞中miRNA大量滲漏進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，從而引起血清中miRNA水平升高[10]。

有學(xué)者證實(shí)，miR-211表達(dá)于人類各種眼組織中，與糖尿病及眼部并發(fā)癥密切相關(guān)，高糖環(huán)境中miR-211表達(dá)顯著增加，對(duì)細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，且可對(duì)細(xì)胞增殖造成抑制，引起組織缺氧、缺血及細(xì)胞功能受損，致使組織失去活性[11]。本研究結(jié)果顯示，DR患者血漿miR-211的表達(dá)水平及血清VEGF水平均顯著高于單純2型糖尿病患者及健康受試者，且PDR患者血漿miR-211的表達(dá)水平及血清VEGF水平亦顯著高于NPDR患者，分析原因可能為高表達(dá)的miR-211對(duì)視網(wǎng)膜血管微環(huán)境中的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，破壞視網(wǎng)膜血管的結(jié)構(gòu)，增加通透性，進(jìn)而使miR-211表達(dá)水平增加[12]。

本研究結(jié)果還顯示，DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程對(duì)DR患者血漿miR-211的相對(duì)表達(dá)量均有一定的影響作用，且DR患者糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平與miR-211的相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)。由于血糖控制不佳會(huì)造成DR病情加重，糖化血紅蛋白可有效反饋血糖的控制水平，作為晚期糖基化的一種產(chǎn)物，其濃度的增加及大量的沉積會(huì)使糖基化中的膜產(chǎn)物受體表達(dá)被激活，促進(jìn)氧自由基的釋放，引起組織缺氧，增加血管的通透性，誘發(fā)形成新生血管，使DR病情加重[13]。VEGF在促進(jìn)血管生成中具有關(guān)鍵性作用，可直接影響新血管生成及血管通透性，與DR疾病進(jìn)展關(guān)系密切。血糖控制不佳會(huì)引起miR-211表達(dá)水平增加，損害血管內(nèi)皮，影響血管內(nèi)皮功能，從而加重DR病情[14]。此外，本研究還通過ROC曲線分析證實(shí)，血漿miR-211的表達(dá)水平對(duì)DR具有較高的臨床診斷效能。

綜上所述，DR患者miR-211表達(dá)水平顯著高于單純2型糖尿病患者及健康受試者，且受DR分期、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF及病程影響，并與糖化血紅蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平呈正相關(guān)，對(duì)DR具有較高的診斷效能，后續(xù)研究中我們將會(huì)擴(kuò)大樣本量，并納入民族、地域等因素，進(jìn)一步對(duì)miR-211在視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。