三陰性乳腺癌患者新輔助化療后血清miR-335、miR-146a的表達及臨床意義

王冰，王月鵬，陳北平

(盤錦市中心醫院腫瘤內科，遼寧盤錦124000)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast carcinoma，TNBC)患者乳腺癌組織免疫染色檢測雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體2表達均為陰性，約占乳腺癌的15%～20%。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NAC)已廣泛用于治療TNBC，但腫瘤對化療藥物具有耐受性[1]，因此，TNBC生物學標志物用于NAC療效預測成為目前研究熱點。微小RNA(microRNA，miRNA)作為內源性非編碼單鏈RNA，調控大部分基因的表達，在應激反應、細胞增殖等進程中發揮重要作用[2]。研究發現，miR-335和miR-146a異常表達與乳腺癌細胞的增殖、侵襲有關[3-4]。有學者發現，血清miR-335表達降低參與了乳腺癌發生，可作為早期診斷乳腺癌的指標[5]；miR-146a過表達可增強乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性[6]。但二者與NAC治療后TNBC發生、發展的關系尚不十分明確。本研究旨在測定TNBC患者血清miR-335和miR-146a的表達水平，并分析其與NAC療效、患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年6月至2018年6月盤錦市中心醫院腫瘤內科就診且經NAC治療并行改良根治性手術、乳腺癌保乳手術、乳腺單切除的TNBC患者84例作為TNBC組，年齡(45.06±4.07)歲，均為女性。納入標準：(1)經病理組織學確診為TNBC[7]；(2)非哺乳期或妊娠期患者；(3)臨床病理資料完整。排除標準：(1)除三陰性乳腺癌外還患有其他腫瘤；(2)肝腎功能不全者。其中浸潤性導管癌71例，浸潤性小葉癌13例。未絕經患者49例，絕經患者35例。美國癌癥聯合委員會(american joint committeeon cancer，AJCC)臨床分期：Ⅱ期54例，Ⅲ期30例。另選取行手術治療的非三陰性乳腺癌患者84例(乳腺纖維腺瘤37例，乳腺導管擴張癥25例，乳腺囊性增生22例)作為非TNBC組，年齡(44.93±5.08)歲，均為女性；收集同期于體檢中心體檢健康者84例作為健康人對照組。年齡(44.27±5.19)歲，均為女性。3組受試者年齡間差異無統計學意義(F=0.652，P=0.522)。本研究經盤錦市中心醫院醫學倫理委員會批準(批準文號：2015117)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2TNBC患者NAC方案及隨訪 所有TNBC患者手術前均接受NAC方案：阿霉素聯合環磷酰胺、表阿霉素聯合環磷酰胺或紫杉類藥聯合以上方案。4個療程后行手術治療，手術后繼續化療2個療程，化療過程中根據病情需要可提前進行手術治療。NAC治療后64例患者行改良根治性手術，12例患者行保乳手術，8例患者行乳腺單切除手術。根據NAC治療后是否病理完全緩解(pathologic complete response，pCR)，分為pCR組32例和非pCR組52例。TNBC患者出院后，采取電話隨訪、門診復查、住院檢查的方式進行隨訪，隨訪時間為6～36個月，以患者死亡、失訪或最后1次隨訪時間為終點。記錄隨訪期間患者的生存狀況。

1.3樣本采集 健康人對照組于體檢當日，非TNBC組患者于入院第2日清晨，TNBC組患者于NAC治療前及治療4、6個療程后，采集清晨空腹靜脈血6 mL，室溫下靜置20 min，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃保存。

1.4試劑和儀器 RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司),逆轉錄試劑盒及實時熒光定量(quantitative real-time，RT-qPCR)試劑盒(美國Bioworld公司)。UV-3200紫外分光光度計(上海美譜達儀器公司),CFX96型RT-qPCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.5RT-qPCR檢測血清中miR-335、miR-146a的表達水平 取各組血清樣本100 μL，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，取UV-3200紫外分光光度計檢測吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0之間的樣本，置于-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。根據GenBank中提供的miR-335(序列號：NC_000072.7)、miR-146a(序列號：NC_000005.10)及U6(序列號：NC_015438.3)的基因序列，由上海吉瑪生物公司設計并合成。miR-335上游引物序列：5′-TAGCTTATCAGACTG-A-3′，下游引物序列：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，退火溫度60 ℃，產物片段大小217 bp。miR-146a上游引物序列：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物序列：5′-CCCATGGAATTCAGTTCTCATT3′，退火溫度63 ℃，產物片段大小269 bp。U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，退火溫度60 ℃，產物片段大小253 bp。按照RT-qPCR試劑盒說明書進行擴增，PCR總反應體系為20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 4 μL。循環參數：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 s，共45個循環。以U6為內參照，采用2-△Ct法對miR-335、miR-146a的表達水平進行定量分析。

1.6統計學分析 使用SPSS 22.0軟件進行數據的處理和分析，計量資料采用兩獨立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析，存在差異時以LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。采用Pearson檢驗分析NAC治療前后TNBC患者血清miR-335與miR-146a表達水平的相關性；采用Kaplan-Meier法分析NAC治療后miR-335、miR-146a表達水平與TNBC患者3年生存率的關系；采用Cox回歸分析影響TNBC患者NAC治療后預后的危險因素。

2 結果

2.1各組血清miR-335、miR-146a表達水平的比較 健康人對照組miR-335、miR-146a的表達水平分別為1.02±0.12、1.01±0.12，非TNBC組miR-335、miR-146a的表達水平分別為0.81±0.20、0.87±0.22，TNBC組miR-335、miR-146a的表達水平分別為0.43±0.08、0.56±0.11，3組間比較差異均有統計學意義(F值分別為370.678、178.430，P均<0.01)。此外，與健康人對照組相比，非TNBC組、TNBC組血清miR-335、miR-146a的表達水平均降低(miR-335的t值分別為13.520、37.984，miR-146a的t值分別8.121、26.102，P均<0.05)；與非TNBC組相比，TNBC組血清miR-335、miR-146a的表達水平均降低(t值分別為24.464、17.981，P均<0.05)。

2.2TNBC患者NAC治療前后血清miR-335、miR-146a表達水平的比較 NAC治療前miR-335、miR-146a的表達水平分別為0.43±0.08、0.56±0.11，NAC治療4個療程后miR-335、miR-146a的表達水平分別為0.51±0.10、0.70±0.18，NAC治療6個療程后miR-335、miR-146a的表達水平分別為0.75±0.17、0.83±0.21，3組間比較差異均有統計學意義(F值分別為154.278、51.860，P均<0.01)。與NAC治療前相比，NAC治療4、6個療程后血清miR-335、miR-146a的表達水平均升高(miR-335的t值分別為5.967、23.867，miR-146a的t值分別7.466、14.399，P均<0.05)；與NAC治療4個療程后相比，NAC治療6個療程后血清miR-335、miR-146a的表達水平均升高(t值分別為17.900、6.933，P均<0.05)。

2.3NAC治療前miR-335和miR-146a的表達與TNBC患者臨床病理參數關系 血清miR-335、miR-146a表達水平與TNBC患者年齡、臨床分期、腫瘤大小無關(P>0.05)，而與有無淋巴轉移、有無脈管瘤栓相關(P<0.05)。結果見表1。

表1 NAC治療前miR-335和miR-146a的表達與TNBC患者臨床病理參數的關系

2.4NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a表達水平的相關性 Pearson檢驗分析發現，NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達水平呈正相關(r=0.493，P=0.000)，NAC治療4、6個療程后TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達水平呈正相關(r分別為0.385和0.402，P均=0.000)。

2.5NAC治療前miR-335、miR-146a表達水平與化療療效的關系 非pCR組miR-335的表達水平為0.38±0.06，顯著低于pCR組的(0.51±0.09)，差異有統計學意義(t=7.947，P=0.000)；而非pCR組miR-146a的表達水平為0.50±0.09，顯著低于pCR組的(0.66±0.12)，差異亦有統計學意義(t=6.956，P=0.000)。

2.6NAC治療后miR-335、miR-146a表達水平與TNBC患者3年生存率的關系 根據NAC治療后miR-335均值(0.75)，將其分為低表達組(44例)和高表達組(40例)，根據NAC治療后miR-146a均值(0.83)，將其分為低表達組(42例)和高表達組(42例)。分析結果表明，經NAC治療后miR-335低表達、miR-146a低表達組TNBC患者的3年生存率(13.64%和11.90%)均顯著低于miR-335高表達和miR-146a高表達(32.50%、33.33%)組患者(χ2值分別為4.260、5.509，P分別為0.039、0.019)。NAC治療后miR-335低表達組TNBC患者的中位生存時間(25.60個月)和miR-146a低表達組患者的中位生存時間(23.80個月)均顯著少于miR-335高表達組患者(33.20個月)和miR-146a高表達組患者(33.02個月)，差異有統計學意義(t值分別為4.524、5.009，P均=0.000)，結果見圖1、2。

圖1 NAC治療后miR-335表達與TNBC患者生存率關系

圖2 NAC治療后miR-146a表達與TNBC患者生存率的關系

2.7影響TNBC患者預后的危險因素 Cox回歸分析結果表明，有脈管瘤栓、NAC治療后miR-335和miR-146a低表達是影響TNBC患者不良預后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表2。

表2 影響TNBC患者NAC治療后預后的危險因素分析

3 討論

miR-335在多種腫瘤中呈異常表達，可能參與了腫瘤的發生、發展進程。研究表明，miR-335低表達與子宮內膜癌發生有關，可作為潛在的診斷標志物[8]。本研究結果發現，血清miR-335表達水平由高至低依次為健康人對照組、非TNBC組、TNBC組，NAC治療6個療程后、NAC治療4個療程后、NAC治療前。這與Hao等[9]研究結果相似，其證實TNBC組織中miR-335呈低表達，且miR-335過表達可增加癌細胞對紫杉醇、順鉑和阿霉素的敏感性，提高化療效果[9]。故而筆者推測血清miR-335表達水平升高可能與TNBC發生有一定關聯，而NAC治療能上調TNBC患者血清中miR-335的表達水平，表明NAC治療可能通過調控miR-335表達改善TNBC疾病狀態。本研究進一步分析發現，血清miR-335水平與TNBC患者有無淋巴轉移、有無脈管瘤栓有關，提示miR-335可能參與TNBC發展進程。此外，與pCR組相比，非pCR組miR-335的表達水平較低，miR-335低表達組TNBC患者3年生存率顯著低于miR-335高表達組患者，且患者中位生存時間也較短，與余進松等[10]的研究結果相似，提示miR-335可能與NAC療效、患者預后有關。

miR-146a作為免疫反應調控因子，在乳腺癌等多種惡性腫瘤中發揮重要的作用[11]。本研究發現，血清miR-146a表達水平由高至低依次為健康人對照組、非TNBC組、TNBC組，NAC治療6個療程后、NAC治療4個療程后、NAC治療前，且組間兩兩比較差異均有統計學意義。提示miR-146a可能參與了TNBC發病過程，而NAC治療能上調TNBC患者血清中miR-146a的表達水平，提示miR-146a高表達可能有助于TNBC治療，其作用機制可能是miR-146a可通過阻滯乳腺癌細胞周期進程，進而發揮抑制乳腺癌細胞增殖的作用[12-13]。miR-146a與TNBC患者有無淋巴轉移、有無脈管瘤栓相關，與付明剛等[13]研究結果類似，提示miR-146a可能通過某種機制在TNBC發生、發展中發揮作用。筆者通過預后隨訪發現，與pCR組相比，非pCR組miR-146a的表達水平較低，miR-146a低表達TNBC患者的生存率亦低于miR-146a高表達患者，且低表達患者的中位生存時間更短，提示miR-146a高表達可能有助于提高NAC療效，延長患者生存時間。但本研究隨訪時間相對較短，今后需延長隨訪年限，繼續探討miR-146a與TNBC患者遠期生存的關系。本研究進一步行Pearson檢驗分析發現，NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達水平呈正相關，且二者低表達是影響NAC治療后TNBC患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-335、miR-146a有望成為評價NAC治療后TNBC患者預后的血清學指標。

綜上所述，NAC治療可上調TNBC患者血清miR-335、miR-146a的表達水平，且與有無淋巴轉移、有無脈管瘤栓、NAC療效、患者生存率有關，有望成為評價NAC療效和預后的生物學指標，但二者參與調控TNBC機制有待于進一步研究。