唐篩高風險和臨界風險孕婦中非21/18三體染色體異常結果分析*

時文麗，袁二鳳，田遠，高金爽，郭亞清，桑敏，楊麗君，張琳琳

(鄭州大學第三附屬醫院，a.婦產科，b.檢驗科，鄭州 450052)

據統計，我國出生缺陷發生率約為5.6%[1]，其中胎兒染色體異常是導致新生兒出生缺陷疾病的重要原因之一。目前我國針對染色體異常的主要產前篩查手段是唐氏綜合征產前篩選檢查(唐篩)和無創產前檢測技術(noninvasive prenatal test, NIPT)。唐篩是利用母體血清學指標[2]對21/18三體綜合征進行風險評估，當胎盤或胎兒結構存在異常時可導致孕婦血清生化指標的改變。NIPT是利用新一代DNA測序技術對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進行測序，特異性識別被檢胎兒是否患21/18/13三體綜合征。故而唐篩的特異性和敏感性均不如NIPT。但多項研究證實，唐篩假陽性結果往往與非21/18三體的染色體異常相關[3-5]。隨著產前診斷技術的發展，染色體微陣列(chmmosomal microamy analysis，CMA)技術和基于二代測序的低深度全基因組拷貝數變異(CNVseq)檢測也逐步應用于臨床，二者可以檢測1×105bp以上的染色體微缺失/微重復。但該兩項技術在產前應用的適應癥中均未提及唐篩高風險或臨界風險人群[6-7]。本研究通過分析自愿選擇CMA或CNVseq技術的人群數據，旨在探討唐篩對非21/18三體染色體異常的檢測出效能，分析致病性或傾向致病性CNVs的檢出率，以期為唐篩高風險和臨界風險孕婦后續產前診斷的實驗室檢測方案的選擇提供數據支持。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2018年12月至2019年12月因唐篩高風險或臨界風險在鄭州大學第三附屬醫院產科門診就診且行羊水CMA或CNVseq檢測的孕婦3 028例，年齡19～45歲，孕齡17～25周。根據產前篩查中心報告的唐篩風險結果分為高風險組(2 555例)和臨界風險組(473例)，其中高風險組為血清學篩查提示21-三體綜合征高風險(≥1∶270)和(或)18-三體綜合征高風險(≥1∶350)的孕婦；臨界風險組為血清學篩查提示21-三體臨界風險(1∶270～1∶1 000)和(或)18-三體臨界風險(1∶350～1∶1 000)的孕婦。所有病例均為自然受孕、單胎妊娠，進行產前診斷前無胎兒超聲異常表現；排除具有染色體異常遺傳病史及家族病史、妊娠前患有基礎疾病(如高血壓、糖尿病、血液疾病、肝腎功能不全及惡性腫瘤)等可能影響母體血清標志物水平因素的孕婦。本研究經鄭州大學第三附屬醫院醫學倫理委員會審核批準(批準文號：2021-WZ-007)，孕婦及家屬簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 GE Voluson E8型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)，臺式高速離心機(美國Thermo Fisher公司)，ABI 9700 PCR System(美國Applied Biosystems公司)，基因組DNA純化濃縮儀(Genomic DNA Clean&Concentrator，美國Zymo公司)，Affymatrix CytoScan 750K芯片(美國Thermo公司)，Nextseq CN500高通量測序儀(美國Illumina公司)。QIAamp血液DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1羊水組織收集 孕婦在完善血常規、血凝、傳染病4項(包括艾滋病、乙肝、丙肝和梅毒)、心電圖、胎兒常規超聲檢查后，在產前診斷門診行B超輔助下羊膜腔穿刺術，無菌抽取羊水8～15 mL，置于4 ℃保存。采集標本時避免血液污染。

1.3.2基因組DNA提取及檢測 采用離心法(15 000 r/min離心10 min)收集離心管底白色沉淀，即胎兒的脫落細胞，按照QIAamp血液DNA純化試劑盒說明書進行細胞DNA抽提。對采用CMA檢測的孕婦，采用短串聯重復(short tandem repeat，STR)位點比對法進行母血污染的鑒定，確認無母血污染后，按照Affymatrix CytoScan 750K芯片說明書進行CMA檢測，包括酶切消化、PCR、標記、雜交芯片掃描等操作。對采用CNVseq檢測的孕婦，采用磁珠法提取DNA，將50 ng DNA用于構建DNA文庫。使用Nextseq CN500高通量測序儀對全基因組DNA進行測序。

1.3.3數據分析 將上述兩種測序方式得到的數據進行序列比對和數據分析，獲取全部≥1×105bp的染色體基因組拷貝數變異。將上述染色體基因組拷貝數變異數據分別與人類染色體變異數據庫(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources，DECIPHER，https://decipher.sanger.ac.uk)、基因變異數據庫(database of genomic variants，DGV，http://projiects.tcag.ca/variation)、細胞基因組國際標準數據庫(International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA，http://www.iscaconsortium.org/)、GeneReviews數據庫(https://www.generreviews.org/)、Clingen數據庫(https://dosage.clinicalgenome.org/)和在線人類孟德爾遺傳數據庫(online Mendelian inheritance in man，OMIM，http://www.omim.org/)中的已有數據進行比對[8]，按照2020年美國醫學遺傳會與基因組學會(ACMG)標準[9]進行致病性分析，將檢出的CNVs分為致病性、傾向致病性、臨床意義不明確、傾向良性、良性5個級別，并著重分析致病性或傾向致病性CNVs。

2 結果

2.1唐篩高風險或臨界風險孕婦的CMA或CNVseq檢測結果 3 028例孕婦中唐篩高風險孕婦2 555例、臨界風險473例，二者共檢出胎兒致病性或傾向致病性染色體異常107例，占3.53%(107/3 028)，其中21/18三體綜合征55例，占1.82%(55/3 028),性染色體異常7例，占0.23%(7/3 028)，致病性或傾向致病性CNVs 44例，占1.45%(44/3 028)。結果見表1。

表1 3 028例孕婦中各種致病性或傾向致病性染色體異常的檢出情況及比較[n(%)]

2.2唐篩高風險或臨界風險孕婦中CNVs的檢出情況 唐篩高風險或臨界風險孕婦經CMA或CNVseq檢測驗證后提示存在CNVs 106例，按照ACMG標準分級，分為致病性CNVs 28例，傾向致病性CNVs 16例。見表2。

表2 CNVs致病性情況分析[n(%)]

按照ACMG標準對CNVs的評級,在28例致病性CNVs中明確綜合征疾病22例，其中1個病例含2個致病性綜合征。包括類固醇硫酸酯酶缺乏癥(STS)9例、Xq28微重復綜合征2例、Digeorge綜合征2例、16p11.2微重復綜合征2例、16p11.2微缺失綜合征、17q21.3微缺失綜合征、16p13.11微缺失綜合征、22q11.2微重復綜合征、PWS/AS綜合征、2q37微缺失綜合征、1q21.1微缺失綜合征、Xp11.23微缺失綜合征各1例。

2.3唐篩高風險組和臨界風險組提示染色體異常檢出率的比較 高風險組和臨界風險組對21/18三體、致病性或傾向致病性非21/18三體染色體異常和CNVs的檢出率結果見表1。分別對兩組進行卡方檢驗，發現唐篩高風險組對21/18三體的檢出率明顯高于臨界風險組，差異具有統計學意義(χ2=4.392，P=0.036)；但對致病性或傾向致病性非21/18三體的染色體異常的檢出率差異無統計學意義(χ2=0.114，P=0.735)；對致病性或傾向致病性CNVs的檢出率差異無統計學意義(χ2=0.003，P=0.958)。

2.421/18三體綜合征與致病性或傾向致病性的CNVs檢出率的比較 納入研究的所有孕婦中胎兒致病性或傾向致病性CNVs的檢出率為1.45%(44/3 028)；胎兒21/18三體綜合征的檢出率為1.82%(55/3 028)。唐氏篩查對21/18三體綜合征的檢出率與致病性或傾向致病性CNVs的檢出率差異無統計學意義(χ2=1.243，P=0.265)。

3 討論

染色體異常是新生兒出生缺陷的重要原因之一，目前唐篩對21/18三體綜合征的產前篩查價值已得到廣泛認可，本研究重點分析唐篩結果陽性孕婦中非21/18三體染色體異常情況。目前產前診斷的方法眾多，其中CMA[10]和CNVseq[11-12]檢測技術是對全基因組進行覆蓋檢測，可發現傳統染色體核型分析不能檢測的染色體微缺失/微重復，且自動化程度高，結果判斷相對客觀。有研究報道，CMA或CNVseq檢測染色體非整倍體及CNVs的敏感性及特異性均為100%[13]。因此，本研究應用CMA和CNVseq檢測技術對唐篩高風險或臨界風險孕婦羊水進行驗證。

唐篩作為一種廣泛應用但特異性不高的產前篩查手段，對于非21/18三體染色體異常也有一定的提示作用。2018年，Lindquist等[14]通過對澳大利亞墨爾本地區2014和2015年行產前檢測的孕婦進行回顧性分析，結果發現在傳統孕早期血清學篩查結果為高風險的人群中，可以檢出大量21/18/13三體綜合征之外的其他染色體異常。2018年，Vogel等[4]在丹麥地區發現孕早期篩查對致病性CNVs具有一定的檢出作用。本研究對唐篩高風險和臨界風險孕婦中染色體異常結果分析顯示致病性或傾向致病性CNVs的檢出率達1.45%，而人群中CNVs總體發病率為0.37%(1/270)，遠高于人群中染色體異常的發生率，說明當唐篩存在高風險或臨界風險時，應考慮到非21/18三體染色體異常，特別是CNVs的可能性。本研究進一步對檢出的致病性CNVs進行分析，發現該類患者多伴有智力低下、精神異常、發育遲緩、多器官畸形等癥狀，但本研究中檢出率最高的類固醇硫酸酯酶缺乏癥(STS)主要表現為皮膚魚鱗樣改變，致死致畸率低，這可能是人群中高發的原因之一，在遺傳咨詢時要告知患者可能存在的相關風險。本研究結果提示高風險和臨界風險人群中21/18三體綜合征與致病性或傾向致病性CNVs的檢出率基本一致，但目前針對唐篩存在風險孕婦行進一步產前診斷多采用染色體核型分析，因此，存在漏診致病性或傾向致病性CNVs的情況。故而建議后續進行產前診斷時應納入CMA或CNVseq檢測技術，避免染色體異常出生缺陷兒的出生。

然而，CMA或CNVseq在檢出致病性或傾向致病性CNVs的同時，也檢出了部分目前臨床意義不明確的CNVs，這給遺傳咨詢時對其的解讀帶來了挑戰和困難，同時也給孕婦及家屬造成困擾。Miller等[15]研究發現，約12%找不到具體原因的先天畸形胎兒是由染色體微缺失微重復導致的。因此，隨著檢測水平的不斷提高，在大量數據研究論證下那些臨床意義不明確CNVs可能是致病性的，這也將成為未來研究的熱點。