彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤治療中利妥昔單抗耐藥與Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α蛋白表達(dá)的相關(guān)性*

劉靜，鄧槿，顧季煒，馬欣玥，宋國(guó)齊，2b

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.血液科，江蘇南通226001)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常見(jiàn)的亞型，每年約占新診斷NHL病例的25%～35%，是一種高度侵襲性疾病，其免疫表型、遺傳學(xué)、臨床表現(xiàn)及預(yù)后都極具異質(zhì)性[1-2]。目前，臨床使用的利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、蒽環(huán)類(lèi)、長(zhǎng)春新堿及潑尼松(R-CHOP)一線治療方案雖明顯改善了DLBCL患者的預(yù)后，但仍有部分包含雙打擊/三打擊(伴有MYC和BCL2/BCL6重排)的患者表現(xiàn)出對(duì)利妥昔單抗耐藥，預(yù)后差[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于雙打擊/三打擊淋巴瘤(DHI/THL)尚無(wú)統(tǒng)一、有效的治療方案。因此，了解利妥昔單抗獲得性耐藥的機(jī)制對(duì)于提高利妥昔單抗療效以及改善預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。Smarcal1是一種DNA重塑蛋白質(zhì)，它可以通過(guò)穩(wěn)定、修復(fù)和重啟停滯的復(fù)制叉以應(yīng)對(duì)MYC等癌基因誘導(dǎo)的DNA復(fù)制壓力。Puccetti等[4]發(fā)現(xiàn)，Smarcal1缺乏會(huì)減慢轉(zhuǎn)基因小鼠(Eμ-myc)淋巴瘤形成并提高生存率。B56-α及B55-α為PP2A調(diào)節(jié)亞基，研究發(fā)現(xiàn)，B56α-PP2A全酶在DT-061(SMAP)特異性結(jié)合下，可選擇性地對(duì)c-Myc去磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)[5]。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，Eya3可通過(guò)B55-α調(diào)控c-Myc中pT58去磷酸化過(guò)程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。本研究擬參照J(rèn)azirehi等[7]的研究，采用“梯度加藥法”誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞系耐藥并進(jìn)行驗(yàn)證；檢測(cè)親本及耐藥細(xì)胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α蛋白表達(dá)變化；進(jìn)一步干擾耐藥細(xì)胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α的表達(dá)以及過(guò)表達(dá)PP2A-B56-α，評(píng)估其對(duì)利妥昔單抗敏感性改變。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 健康人血漿(南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者)，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清FBS(美國(guó)Gibco公司)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)，AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司)，利妥昔單抗注射液(上海羅氏制藥公司)，鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體及PP2A-B56-α單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人 Smarcal1單克隆抗體以及GAPDH單克隆抗體(美國(guó) cell signaling technology公司)，sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α和oe-PP2A-B56-α 以及其陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照(sh-NC、oe-vector)由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)及合成，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑以及Trizol 試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。酶聯(lián)儀(美國(guó) Biotek公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，蛋白免疫印跡電泳設(shè)備及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系OCI-LY10、OCI-LY18均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海保藏中心，取上述生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞系，培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，以1 000 r/min離心5 min,重懸于T75 cm培養(yǎng)瓶中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3耐藥細(xì)胞系模型的建立 采用“梯度加藥法”誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞的耐藥：分別將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的DLBCL細(xì)胞系OCI-LY10、OCI-LY18以5×105/mL的細(xì)胞密度接種于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入0.5 μg/mL濃度利妥昔單抗，12 h后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)正常(約為4～5 d)，在下1個(gè)周期將利妥昔單抗的濃度提高至前1個(gè)周期的2倍，按此方式重復(fù)9個(gè)周期后，獲得對(duì)128 μg/mL利妥昔單抗耐藥的淋巴瘤細(xì)胞系。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將親本及耐藥細(xì)胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養(yǎng)基中，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞為5×104個(gè)，分別加入濃度為0、2、10、50 和100 μg/mL利妥昔單抗，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，溫育48 h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在酶聯(lián)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥組)-A(空白組)]/[A(對(duì)照組)-A(空白組)]×100。采用SPSS 13.0軟件分析藥物的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC50)值，并計(jì)算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥株IC50/親本株IC50。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)亡 將親本及耐藥細(xì)胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養(yǎng)基中，每種細(xì)胞系均分為2組：control組(0 μg/mL利妥昔單抗組)和50 μg/mL利妥昔單抗組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次，Binding buffer緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入FITC-AnnexinV和PI染料各5 μL，避光溫育20 min， buffer緩沖液補(bǔ)足體積至500 μL。BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用BD分析軟件收集熒光信號(hào)，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率(AnnexinV+/PI-)+晚期凋亡率(AnnexinV+/PI+)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6總蛋白質(zhì)提取及western blot 收集LY10及LY18的親本及耐藥細(xì)胞系，預(yù)冷PBS洗滌2次后加入RIPA 蛋白質(zhì)裂解液，冰浴裂解提取總蛋白質(zhì)，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按照制膠試劑盒說(shuō)明書(shū)，取變性后蛋白質(zhì)15 μL(30 μg)加入至125 g/L PAGE凝膠中(上層膠恒壓 80 V,恒壓120 V)，電泳結(jié)束后在300 mA恒壓條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h。加入鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人PP2A-B56-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人Smarcal1單克隆抗體(1∶800稀釋)以及兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶800稀釋) 4 ℃溫育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，結(jié)束后分別加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)和HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)后室溫下避光溫育2 h，TBST洗膜5次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)目的條帶，Image J 4.1 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將2株耐藥細(xì)胞重懸于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含細(xì)胞為5×104個(gè)，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2株耐藥細(xì)胞均分為sh-NC組(NC shRNA轉(zhuǎn)染組)、oe-vector組(vector oeRNA 轉(zhuǎn)染組)、sh-Smarcal1組(Smarcal1 shRNA轉(zhuǎn)染組)、sh-PP2A-B55-α組(PP2A-B55-α shRNA轉(zhuǎn)染組)及oe-PP2A-B56-α組(PP2A-B56-α oeRNA轉(zhuǎn)染組)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中取1個(gè)復(fù)孔轉(zhuǎn)染24 h 后用于CCK-8法檢測(cè)(方法同1.4，向耐藥細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的耐藥細(xì)胞中分別加入0、2、10、50、100 μg/mL利妥昔單抗)，其余2個(gè)復(fù)孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集實(shí)驗(yàn)1.7中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞系(約5×106個(gè))于1.5 mL無(wú)酶EP管中，各加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和比值(A260/280 nm為1.8～2.0)。取1 μg RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。樣本置于-20 ℃保存。采用RT-qPCR檢測(cè)各組sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞系前后的表達(dá)水平，根據(jù)NCBI參考序列Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α(分別為NC_000002.12、NC_000008.11、NC_000001.11)，由廣州銳博生物科技公司使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)及合成。Smarcal1上游引物序列：5′-AGGCCACAGTCCACGTAGT-3′,下游引物序列：5′-GCTGTTGTTTAGGGACCTCTGG-3′；PP2A-B55-α上游引物序列：5′-CCACCTTTATCTCCTGTTGC-3′，下游引物序列：5′-TTTCTCAGGTGAAAGGAGCAG-3′；PP2A-B56-α上游引物序列：5′-CGGGATCCATGTCGTCGCCGTCGCCGC-3′，下游序列：5′-CCGCTCGAGTTATTTGGCACTGGTACTGCTGCG-3′；GAPDH上游序列：5′-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游序列：5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μmol/L上、下引物各0.5 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。利用StepOneTM軟件于62 ℃時(shí)進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt =(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并取平均值。

2 結(jié)果

2.1利妥昔單抗耐藥DLBCL細(xì)胞系鑒定結(jié)果 應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)耐藥細(xì)胞系的存活率結(jié)果表明，在0、2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗作用下，LY10及LY10RR細(xì)胞的IC50分別為(0.91±0.07) μg/mL和(287.40±26.30) μg/mL，耐藥指數(shù)為315.58；LY18及LY18RR細(xì)胞的IC50分別為(4.73±0.24) μg/mL和(532.10±37.95) μg/mL，耐藥指數(shù)為112.41，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.51和15.18，P均<0.001)。各細(xì)胞系細(xì)胞存活率結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A，LY10及LY10RR細(xì)胞存活率；B，LY18及LY18RR細(xì)胞存活率。

2.2利妥昔單抗處理親本與耐藥細(xì)胞系的凋亡差異 50 μg/mL利妥昔單抗處理48 h后，LY10RR和LY18RR細(xì)胞的凋亡率分別為(7.28±1.25)%、 (6.41±1.46)%，與對(duì)照組LY10RR和LY18RR細(xì)胞的凋亡率分別為(4.94±0.79)%、(4.07±1.35)%相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.86和2.90，P值分別為0.06和0.05)，而利妥昔單抗處理48 h后，LY10和LY18細(xì)胞的凋亡率分別為(30.42±5.52)%、(26.46±2.34)%，與對(duì)照組LY10和LY18細(xì)胞的凋亡率分別為(4.09±0.73)%、(3.21±0.32)%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.50和9.86，P均<0.001)。見(jiàn)圖2。

注：A、B，LY10RR以及利妥昔單抗處理LY10RR 48 h后的凋亡比率；C、D，LY10以及利妥昔單抗處理LY10 48 h后的凋亡比率；E、F，LY18RR以及利妥昔單抗處理LY18RR 48 h后的凋亡比率；G、H，LY18以及利妥昔單抗處理LY18 48 h后的凋亡比率。

2.3western blot檢測(cè) Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α蛋白在親本與耐藥 DLBCL 細(xì)胞系中的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，在發(fā)生利妥昔單抗耐藥細(xì)胞系中，Smarcal1和PP2A-B55-α表達(dá)量均增加，PP2A-B56-α表達(dá)水平下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 western blot檢測(cè)Smarcal1、 PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本和耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)

圖3 western blot檢測(cè)Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本及耐藥 DLBCL 細(xì)胞系中的表達(dá)

2.4RT-qPCR檢測(cè)耐藥細(xì)胞系sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α的轉(zhuǎn)染效率 結(jié)果表明，相對(duì)于sh-NC組(均為1.00±1.00)，sh-Smarcal1組LY10RR和LY18RR耐藥細(xì)胞系中Smarcal1的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(分別為0.45±0.05、 0.41±0.07)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.50、8.56，P均<0.01)；sh-PP2A-B55-α組中PP2A-B55-α的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(分別為 0.51±0.05、0.45±0.06)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.05、9.39，P均<0.01)；相對(duì)于oe-vector組(均為 1.00±1.00)，oe-PP2A-B56-α組中PP2A-B56-α的表達(dá)水平明顯上調(diào)(分別為2.33±0.13、3.067±0.23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.05、8.86，P均<0.01)。

2.5轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞對(duì)利妥昔單抗耐藥性的影響 轉(zhuǎn)染后的LY10RR和LY18RR在2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗刺激48 h后，經(jīng)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，sh-Smarcal1組的細(xì)胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為226.9和67.1，P<0.01)，sh-PP2A-B55-α組的細(xì)胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為592.7和377.2，P<0.01)，oe-PP2A-B56-α組的細(xì)胞活力明顯低于oe-vector組(F值分別為734.5和219.9，P<0.01)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 CCK8法檢測(cè)不同濃度利妥昔單抗處理不同細(xì)胞系的細(xì)胞存活率

注：A，CCK-8法檢測(cè)不同濃度利妥昔單抗對(duì)轉(zhuǎn)染sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY10RR細(xì)胞活力的影響；B，CCK-8法檢測(cè)不同濃度利妥昔單抗對(duì)轉(zhuǎn)染 sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY18RR細(xì)胞活力的影響。

3 討論

Puccetti等[4]通過(guò)持續(xù)調(diào)控MYC失調(diào)，產(chǎn)生慢性復(fù)制應(yīng)激，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤形成，證實(shí)了Smarcal1的雙等位基因失活可抑制腫瘤的進(jìn)展，提示惡性腫瘤可能依賴于Smarcal1以穩(wěn)定復(fù)制叉并完成復(fù)制。在本研究中，成功構(gòu)建了穩(wěn)定的利妥昔單抗耐藥的“雙重打擊”淋巴瘤衍生細(xì)胞系LY10RR和LY18RR，并發(fā)現(xiàn)在耐藥株中Smarcal1表達(dá)量明顯增加；而進(jìn)一步干擾Smarcal1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗對(duì)耐藥細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用均增強(qiáng)。這與Puccetti等[4]的研究結(jié)果較為一致，均證實(shí)抑制Smarcal1可延緩淋巴瘤形成。但本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步證實(shí)了Smarcal1與DLBCL治療中利妥昔單抗耐藥相關(guān)。

MYC基因和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的失活是癌癥中常見(jiàn)的2種類(lèi)型，該2種蛋白質(zhì)均為細(xì)胞增殖、凋亡和分化的重要調(diào)節(jié)因子，它們直接或間接調(diào)節(jié)彼此的生物活性。研究表明，針對(duì)MYC/PP2A通路是臨床上可行的治療策略[8]。PP2A的特定功能通常由其包含的特定調(diào)節(jié)亞基——B亞基控制。Leonard等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DT-061(SMAP)可以特異性穩(wěn)定B56α-PP2A全酶，使后者可選擇性的對(duì)底物c-Myc等去磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Eya3可通過(guò)PP2A的B55-α亞基控制c-Myc基因的pT58位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。在本研究中發(fā)現(xiàn)耐藥株中PP2A-B55-α表達(dá)量增加以及PP2A-B56-α表達(dá)量下降；進(jìn)一步在2株耐藥細(xì)胞中分別干擾PP2A-B55-α和過(guò)表達(dá)PP2A-B56-α，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗對(duì)LY10RR和LY18RR的細(xì)胞毒作用均增強(qiáng)。本研究結(jié)果與Leonard等[5]和Zhang等[6]的研究結(jié)果類(lèi)似，均證實(shí)了在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中抑制PP2A-B55-α蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)PP2A-B56-α蛋白表達(dá)會(huì)增強(qiáng)其對(duì)利妥昔單抗的敏感性。因此，筆者認(rèn)為Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α均可導(dǎo)致MYC基因失調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從而在利妥昔單抗耐藥形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，本研究?jī)H檢測(cè)上述3種蛋白質(zhì)在利妥昔單抗耐藥前后DLBCL細(xì)胞中的表達(dá)水平變化，對(duì)其下游的相互作用靶點(diǎn)尚未確定。今后還需要進(jìn)一步深入的研究來(lái)闡明其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制，以確認(rèn)Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α作為利妥昔單抗耐藥DLBCL治療和診斷靶點(diǎn)的潛能。