安羅替尼聯合氯喹促進人非小細胞肺癌細胞系H1299凋亡

劉細幫，朱林芝，焦德敏，唐夏莉，陳 君，胡旭鋼，陳清勇*

(1.溫州醫科大學 第一臨床醫學院， 浙江 溫州 325000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第903醫院 呼吸與危重癥醫學科，浙江 杭州 310000)

肺癌(lung cancer)是所有癌中病死率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的85%。目前NSCLC的治療進入個體化治療和精準治療的時代，然而預后仍然很差，5年生存率不足20%[1-2]。

安羅替尼(anlotinib)是新型口服酪氨酸多激酶抑制劑，通過抑制多種促血管生成信號[vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)、platelet-derived growth factor receptor(PDGFR),fibroblast growth factor receptor(FGFR)等]的激活[3]；安羅替尼作為三線治療方案耐受性良好，改善了中國患者的無進展生存期和總生存期[4]；最新的指南將其寫入了三線治療的Ⅰ類推薦。但安羅替尼對部分NSCLC細胞敏感性較低[5]，細胞實驗結果也顯示安羅替尼對部分NSCLC細胞的IC50依然很高；因此，如何提高這些NSCLC細胞對安羅替尼的敏感性尚需進一步研究。自噬在癌中的作用是動態的；雖然自噬可抑制正常組織中發生腫瘤，但腫瘤也可依靠自噬促進和維持腫瘤的生長[6]。氯喹(chloroquine，CQ)可抑制惡性腫瘤的自噬及其相關的上下游因子[7]；研究表明，氯喹聯合靶向藥在胰腺癌中具有顯著的協同抗腫瘤活性[8]。為此，本實驗通過研究安羅替尼和CQ聯合對非小細胞肺癌細胞的抑制作用，探討其潛在的機制，為NSCLC的臨床聯合治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人非小細胞肺癌細胞系H1299(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培養液(浙江森瑞生物科技公司)；安羅替尼(正大天晴藥業公司)；氯喹和兔抗人LC3抗體(Sigma-Aldrich公司)；MTT試劑(武漢博士德生物公司)；結晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；Transwell小室(Corning公司)；兔抗人p62和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：用含10% FBS的RPMI-1640培養液，在37 ℃、5% CO2條件下培養H1299細胞；每2～3 d按1∶3的比例傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率：將細胞培養至對數增殖期后，以每孔3×103個細胞接種于96孔板，常規培養24 h后；加入100 μL含不同濃度的CQ(0、10、20、40和80 μmol /L)及安羅替尼(0、2、4、8、16、32和64 μmol/L)聯合或不聯合CQ(20 μmol/L)培養基，每個濃度設5個復孔；繼續培養24 h后，加入20 μL MTT，繼續培養4 h。棄培養液，加入DMSO 150 μL，振蕩，使結晶溶解。在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(藥物組-調零組)/(對照組-調零組)×100%。

1.2.3 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移：將細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達到80%～90%后，用100 μL移液頭垂直于培養板劃痕，PBS洗滌，在顯微鏡下觀察、拍照，記為0 h劃痕寬度。將細胞分成4組，分別為對照組、CQ組(20 μmol/L)、安羅替尼組(5 μmol/L)和聯合組(5 μmol/L安羅替尼+20 μmol/L CQ)，加入無血清培養基，繼續培養24 h后在同一觀察點測量劃痕寬度，計算細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲：將細胞制成2×108個/L的細胞懸液，向小室內加入200 μL的細胞懸液，按1.2.3所述分組，向24孔板中加入600 μL含各組藥物的血清培養基，每個濃度設3個復孔；培養24 h后，取出小室，甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min。隨機挑選5個視野拍照并計數。侵襲率(%)=藥物組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數×100%。

1.2.5 Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡：將細胞接種于24孔板，待細胞匯合至60%～70%，將細胞分成4組，分別為對照組、CQ組(20 μmol/L)、安羅替尼組(20 μmol/L)和聯合組(20 μmol/L安羅替尼+20 μmol/L CQ)，每個濃度設3個復孔；繼續培養24 h后，棄培養液，PBS洗滌，甲醇固定20 min，加入終濃度為5 mg/L Hoechst 33342染液，室溫避光反應10 min，棄去染液。在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞大小及核形態變化。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白水平：按結果4所述的分組處理細胞，培養24 h后提取總蛋白，測定樣品蛋白濃度；在細胞總蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水使其充分變性。然后用SDS-PAGE分離蛋白，經蛋白轉膜、封閉、Ⅰ抗(LC3、p62抗體1∶1 000稀釋，GAPDH抗體1∶10 000稀釋)及Ⅱ抗孵育雜交后進行ECL反應暗室顯影；以GAPDH為內參，采用Image J軟件對目的蛋白進行定量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度安羅替尼聯合CQ對H1299細胞存活率的影響

不同濃度(0～80 μmol/L)的CQ單藥處理24 h后，CQ對H1299細胞的存活率均無明顯抑制作用(圖1A)。而不同濃度的安羅替尼單藥處理后細胞存活率低于對照組，且隨濃度的增加，對細胞存活率的抑制作用逐漸增強。兩藥聯合組處理的細胞存活率顯著低于單藥安羅替尼組(P<0.05)(圖1B)；安羅替尼組和聯合組的IC50分別為47.84 μmol/L、27.31 μmol/L。

A.effect of CQ on the viability of H1299 cells；B.effect of different concentrations of anlotinib(0,2,4,8,16,32,64 μmol/L) with or without CQ(20 μmol/L) on the viability of H1299 cells；*P<0.05 compared with the anlotinib+CQ group

2.2 安羅替尼聯合CQ對H1299細胞遷移和侵襲的影響

對照組、CQ組、安羅替尼組和兩藥聯合組細胞愈合率分別為(29.26±3.46)%、(23.22±1.70)%、(5.00±0.62)%和(1.00±1.93)%；CQ對H1299細胞的愈合率無明顯抑制作用；安羅替尼組和聯合組處理H1299細胞愈合率均低于對照組(P<0.001)，聯合組愈合率相較單藥安羅替尼組更低(P<0.001)(圖2A)。

對照組、CQ組、安羅替尼組和兩藥聯合組侵襲率分別為(100.00±7.59)%、(101.69±3.35)%、(73.52±3.05)%和(50.85±3.59)%；安羅替尼組、聯合組侵襲的H1299細胞均顯著少于對照組(P<0.001)；聯合組侵襲的細胞顯著少于單藥安羅替尼組(P<0.001)(圖2B)。

A.wound-healing test(×40)；B.transwell assay(×200)

2.3 安羅替尼聯合CQ對H1299細胞凋亡的影響

對照組和CQ組無明顯凋亡細胞，細胞核染色較淺，呈現均勻彌散的藍色熒光。而安羅替尼組和聯合組均可見凋亡細胞，細胞呈致密濃染的藍色熒光，核碎裂及核固縮明顯，其中聯合組更明顯，且細胞密度更低(圖3)。

A.control；B.CQ；C.anlotinib；D.anlotinib+CQ(×200)

2.4 安羅替尼聯合CQ對H1299細胞自噬相關蛋白的影響

與對照組相比，5、10和20 μmol/L安羅替尼組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平明顯升高(P<0.05)；5和10 μmol/L安羅替尼處理時p62蛋白表達水平上升，而在20 μmol/L時p62蛋白的表達水平明顯下降(P<0.05)(圖4A)。

CQ組處理H1299細胞后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)。20 μmol/L安羅替尼聯合CQ組處理H1299細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平顯著高于各單藥組(P<0.05)；而20 μmol/L安羅替尼聯合CQ組的p62蛋白表達水平明顯低于CQ組(P<0.05)(圖4B)。

A.effect of anlotinib on autophagy-related proteins；B.effect of anlotinib combined with CQ on autophagy-related proteins；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001 compared with the control group； #P<0.05 compared with the CQ group；△P<0.05 compared with the anlotinib group

3 討論

安羅替尼目前已被獲批三線治療NSCLC、 晚期軟組織肉瘤與晚期小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)的靶向藥物[4,9-10]，治療前景光明。但其IC50和毒副作用相對于一線靶向藥物和傳統化療藥物等較大[5,11]。因此，降低安羅替尼在非小細胞肺癌治療中的劑量具有重要意義。本研究顯示，相較于單獨安羅替尼，其聯合CQ更加顯著抑制H1299細胞存活率，IC50從47.84 μmol/L下降至27.31 μmol/L，二者具有協同效應；并且本研究結果表明可能與細胞自噬相關。

自噬是體內平衡的一個重要過程，自噬與細胞凋亡密切相關，自噬可以抑制細胞凋亡，但長期激活自噬也會導致細胞凋亡。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)是自噬關鍵調控因子，控制自噬膜生長、自噬物質識別及自噬小體與溶酶體融合過程的主要步驟[12]。自噬底物p62/SQSTM1能夠結合Atg8/LC3的銜接蛋白，且p62蛋白的積累認為是自噬清除率不足的指標[13]。本研究顯示，安羅替尼使H1299細胞自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平顯著升高，而p62蛋白表達水平逐漸下降；自噬抑制劑CQ聯合安羅替尼處理使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平增加，同時下調p62蛋白表達水平；證明了在體外安羅替尼可以誘導肺癌細胞自噬，自噬抑制劑CQ聯合安羅替尼以自噬激活為主。

CQ抑制溶酶體的酸化和與自噬小體的融合，以防止其在后期自噬過程中的降解，從而抑制自噬進程[14]。在本研究中，CQ抑制H1299細胞的自噬，干擾了細胞的正常自噬過程，使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62表達增加；而安羅替尼可以誘導肺癌細胞自噬，使細胞中發生了抑制自噬和激活自噬之間的矛盾，并反映在細胞存活率上。與單獨安羅替尼處理相比，聯合治療不僅在抑制細胞遷移和侵襲方面加強，而且也增強誘導細胞凋亡。

綜上所述，安羅替尼聯合CQ具有增強對NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移抑制作用，并促進細胞凋亡，其機制可能與細胞自噬有關；本研究為進一步豐富安羅替尼聯合CQ的抗腫瘤作用提供了新的實驗依據。