上調蛋白激酶D2表達減輕小鼠肺缺血/再灌注損傷

劉浩明，華 毛，張 莉，朱海宏

(青海省第五人民醫院1.胸外科；2.頭頸外科，青海 西寧810007；3.青海省人民醫院 胸外科，青海 西寧810007)

肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury, LI/RI)是指肺組織經歷一定時間缺血再次恢復血流供應后，其功能代謝障礙及結構功能破壞出現加重的現象，是肺移植手術失敗和患者死亡的主要原因[1-3]。低氧誘導因子-1 α(hypoxic inducible facter 1α，HIF-1 α)/血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)信號通路與LI/RI密切相關，HIF-1 α是調節細胞氧穩態的核心轉錄因子，VEGF可促血管生成，該信號通路可在缺氧條件下被激活[4-5]。蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，研究報道，PKD2的表達可能影響組織缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/RI)后的細胞修復反應，在維持血管壁完整性、穩定性中具有重要作用，但PKD2在LI/RI中的作用尚不清晰[6]。本研究建立小鼠LI/RI模型，以HIF-1 α/VEGF信號通路為切入點，探討PKD2對LI/RI的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57BL/6J野生型(WT)小鼠20只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)；PKD2基因過表達(PKD2+/+)小鼠40只(Jackson實驗室)。實驗小鼠均為6～8周齡，體質量18～22 g，雌雄各半。實驗動物及飼養條件符合《實驗動物管理條件》要求。

1.1.2 試劑(盒)：戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、ECL發光液、PVDF轉印膜和Trizol(北京索萊寶科技有限公司)；2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2ME)、蛋白定量試劑盒、蛋白Marker(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；引物(TaKaRa公司)；HIF-1 α、VEGFA、GAPDH兔源重組單克隆抗體，羊抗兔二抗(CST公司)；中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將C57BL/6J WT小鼠和C57BL/6J PKD2+/+小鼠分別隨機分為假手術組(WS和PS組;W.WT; P.PKD2+/+)、LI/RI組(WIR和PIR組，無創顯微血管夾夾閉左側肺門60 min，松開血管夾再灌注120 min)和HIF-1α抑制劑2-ME組[(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組，造模前2 d腹腔注射20 mg/(kg·d)2ME]，每組10只[7]。

1.2.2 肺組織濕/干重比(W/D)的檢測：分離小鼠肺組織，記錄濕重(W)，然后放置于恒溫干燥箱(80 ℃)烘烤48 h，記錄干重(D)，濕重與干重之比即為W/D。

1.2.3 HE染色觀察肺組織病理變化：將肺組織置于4%多聚甲醛中固定處理48 h，制作組織切片，脫蠟、復水后行HE染色。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測肺組織中炎性因子：取大鼠肺組織，冰上勻漿，3 000 r/min離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.2.5 RT-qPCR檢測肺組織HIF-1α和VEGFAmRNA表達：大鼠肺組織研磨勻漿后，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，所有樣品均以GAPDH為內參。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×緩沖液5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復40個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△Ct的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 Western blot檢測肺組織HIF-1 α和VEGFA蛋白表達：提取各組大鼠肺組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL的HIF-1 α和VEGFA兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶2 000，4 ℃環境下孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶2 000)中，在37 ℃環境下孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發光液，反應1 min后置于凝膠成像系統顯影。免疫印跡實驗的內參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應的吸光度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白吸光度值/內參蛋白吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肺組織濕/干重比(W/D)值比較

WS組W/D值為(4.11±0.62)，PS組為(3.92±0.81)，WIR組為(7.80±1.10)，PIR組為(4.83±0.72)，WIR+2ME組為(10.02±1.19)，PIR+2ME組為(9.77±0.95)。與WS組比較，WIR組W/D值增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組W/D值降低(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組W/D值均增加(P<0.05)；但兩組之間差異無統計學意義。

2.2 肺組織病理學形態比較

WS組和PS組小鼠肺組織結構清晰，肺泡完整，肺間質中未見明顯炎性細胞浸潤現象；與WS組比較，WIR組小鼠的肺組織可見肺泡被明顯破壞并伴有水腫，肺泡腔中有大量炎性細胞浸潤和紅細胞滲出；與WIR組比較，PIR組小鼠的肺組織損傷程度較輕，肺泡和肺間質輕度水腫，炎性細胞浸潤較少，未見明顯出血現象；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組小鼠肺組織損傷進一步加重，炎性細胞浸潤和充血水腫程度明顯(圖1)。

圖1 肺組織病理學形態比較

2.3 肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量則顯著減少(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高(P<0.05)(圖2)。

A.TNF-α (pg/mL); B.IL-1β (pg/mL); C.IL-6 (pg/mL); *P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

2.4 肺組織HIF-1 α和VEGFA mRNA表達水平比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA的mRNA水平增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA的mRNA水平增加(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組HIF-1 α和VEGFA mRNA水平顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

2.5 肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達顯著減少(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組HIF-1 α和VEGFA蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

3 討論

LI/RI是肺移植手術后器官衰竭和患者死亡的常見原因，其發生機制雖得到廣泛研究，但尚未完全闡明，也導致臨床缺乏有效的特異性藥物治療[8-9]。PKD家族是屬于Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶的一組獨立蛋白激酶家族，在細胞的增殖、分化和凋亡過程中發揮重要調控作用[10]。研究表明，PKD2可增強部分組織和細胞對I/RI的耐受性，保護細胞免受氧化應激損傷，抑制炎性因子的表達[11]。目前，PKD2基因在LI/RI中的作用尚不清晰，因此，本研究構建了PKD2基因過表達小鼠LI/RI模型，探究PKD2在LI/RI中的作用及其機制。

本研究發現，WIR組小鼠肺組織W/D值高于WS組，肺組織損傷明顯，而PIR組小鼠W/D值降低，肺組織損傷減輕，表明PKD2基因高表達可改善小鼠肺組織損傷。LI/RI的顯著特點是疾病進展過程中產生大量促炎因子[12]。本研究發現，LI/RI使小鼠肺組織炎性因子TNF-α、 IL-1β和IL-6的含量顯著增加，而PKD2過表達后炎性因子含量明顯降低，表明PKD2基因高表達可抑制炎性因子的釋放。哺乳動物細胞普遍具有對缺氧或缺血性損傷的自我保護能力，HIF-1 α是這一過程中的關鍵調節因子[13]。常氧條件下，HIF-1 α被大量降解，表達水平較低，在低氧條件下則被大量激活，調節下游VEGFA等多種靶基因的轉錄和表達，發揮在低氧環境中保護組織器官的代償作用[14]。本研究發現，LI/RI使小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA mRNA及蛋白表達增加，PKD2過表達后HIF-1 α和VEGFA mRNA及蛋白表達顯著增加，表明PKD2基因高表達可能促進HIF-1 α/VEGFA信號通路的活化。為了進一步探究PKD2是否通過HIF-1 α/VEGFA信號通路調控LI/RI，我們對LI/RI小鼠使用了HIF-1 α抑制劑2-ME，結果顯示，HIF-1 α抑制劑使(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組小鼠肺組織W/D值增加，肺組織損傷進一步加重，炎性因含量均升高，PKD2對LI/RI的保護和改善作用被取消，而HIF-1 α mRNA及蛋白表達被2-ME降低的同時，VEGFA mRNA及蛋白表達亦顯著降低，(PIR+2ME)組上述指標的變化與(WIR+2ME)組比較差異無統計學意義，表明HIF-1 α/VEGFA信號通路的表達上調可減輕LI/RI，PKD2基因對LI/RI的調控是通過HIF-1 α/VEGFA信號通路實現的。

綜上所述，PKD2基因表達上調可改善小鼠LI/RI，其機制可能與增加HIF-1 α/VEGFA信號通路的表達有關。