RNA干擾降低膀胱TGF-β1表達能夠改善脊髓損傷大鼠的膀胱功能和纖維化

賈春松，趙彥坡，尚振華，邢添瑛，歐彤文*

(1.首都醫科大學宣武醫院 泌尿外科， 北京 100053； 2.門頭溝區醫院 神經內科， 北京 102300)

骶上脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)通常導致神經源性膀胱(neurogenic bladder，NB)，表現為逼尿肌過度活動(detrusor over activity，DO)和膀胱纖維化等膀胱功能和結構異常以及尿急、尿頻、尿失禁和尿潴留等臨床癥狀。轉化生長因子β (transforming growth factor β，TGF-β)是調節細胞生長、分化和免疫功能的細胞因子之一[1]，其中，TGF-β1是促進組織纖維化的重要因子[2]，它可能是治療NB的靶點。但是，目前相關研究較少。在本研究中，用慢病毒介導的短發夾RNA(sh-TGF-β1)靶向干擾膀胱TGF-β1 mRNA表達，并從膀胱功能和纖維化兩個方面，探討RNA干擾(RNA interference,RNAi)降低膀胱TGF-β1表達，治療脊髓損傷大鼠NB的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：PCR引物(上海吉凱基因醫學科技股份有限公司)； DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；Prime-Script RT試劑盒和一步法SYBR RT-qPCR試劑盒(TaKaRa公司)；兔抗TGF-β1單克隆抗體(Abcam公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；12.5% SDS-PAGE凝膠、PVDF膜(Bio-Rad公司)；TGF-β1 RNAi慢病毒載體LV-shTGF-β1及其對照慢病毒載體LV-vector為本實驗室既往構建[3]。

1.1.2 動物：Wistar雌性大鼠[北京維通利華，使用許可證號：SYXK(京)2017 -0033]，SPF級，體質量(200±10)g。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分為4組：假手術組(sham)、T10脊髓橫斷組(T10 transec-tion)、LV-vector和LV-shTGF-β1組，每組12只。將大鼠用2%異氟醚麻醉后，假手術組行T10脊髓橫斷假手術，其余3組行T10脊髓橫斷。脊髓術后，下腹部正中開口，行膀胱肌層注射(每只80 μL)：假手術組和T10脊髓橫斷組為0.9%氯化鈉溶液，LV-vector組為LV-vector 1×108pfu/只，LV-shTGF-β1組為LV-shTGF-β1 1×108pfu/只。大鼠膀胱壁注射方法和術后護理見既往報道[4]。本實驗通過本院倫理委員會批準。

1.2.2 膀胱測壓、稱重和取材：在脊髓術后第28天，將大鼠稱重，按既往方法行清醒大鼠膀胱測壓[4]。記錄液體從尿道流出前，DO的頻率、幅度及膀胱容量。DO定義為：節律性逼尿肌壓較基線升高超過7 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，但是沒有液體從尿道流出[4]。測壓后處死大鼠，摘取膀胱稱重，并將膀胱通過矢狀面和冠狀面分為4塊，其中3塊剝離膀胱黏膜和漿膜，保留逼尿肌層并保存在液氮中；另一塊用4%甲醛固定后石蠟包埋。

1.2.3 HE染色檢測逼尿肌纖維化：將石蠟包埋的膀胱組織制成4 μm切片，分別行HE和Masson染色。每只大鼠隨機選取3張HE切片，在放大倍數×10時，隨機選取每張切片中逼尿肌層的3個區域，用Fiji-win64(NIH Image)軟件分析逼尿肌纖維化程度，其計算方法為：間質組織百分比=(間質組織面積/逼尿肌面積)×100。

1.2.4 免疫組化法檢測TGF-β1 蛋白：每只大鼠隨機選取3張4 μm石蠟切片，進行免疫組化染色。其中，一抗為兔抗TGF-β1單克隆抗體(1∶200)，二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶50)。在放大倍數×10時，隨機選取切片中逼尿肌層的3個區域，用Fiji-win64(NIH Image)軟件進行分析，TGF-β1表達用平均吸光度(average absorbance)×100表示。

1.2.5 Western blot檢測TGF-β1 蛋白：將凍存的逼尿肌勻漿后，4 ℃ 12 000×g離心10 min，并收集上清。將蛋白按30 μg/只大鼠，用12.5% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。將PVDF膜用一抗兔抗TGF-β1單克隆抗體(1∶50 000)和小鼠抗GAPDH 單克隆抗體(1∶10 000)在4 ℃下孵育過夜，接著用二抗HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)和HRP標記的山羊抗小鼠IgG (1∶40 000)在室溫下孵育1 h。每個樣本重復檢測3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測TGF-β1 mRNA：將凍存的逼尿肌勻漿后，按Trizol試劑和Prime-Script RT試劑盒說明制備cDNA。RT-qPCR的引物為：TGF-β1(上游引物：5′-GCTGAAGCCGTTCATTTAGC-3′；下游引物：5′-GAGGAGGCCAAATTCAACAA-3′)、GAPDH(上游引物：5′-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTG-3′； 下游引物：5′-AGAAGGCAGCCCTGGTAACC-3′)。RT-qPCR的反應體系為：1 μL cDNA (10 ng)，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP，0.2 μL Ex Taq?Hot Start Version，2 μL SYBR Green Ⅰ，1 μL (10 μmol)上游引物， 1 μL(10 μmol)下游引物和11.8 μL DEPC處理水；擴增條件為：95 ℃變性2 min，再擴增40個循環(95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s)，72 ℃ 30 s。每個樣本重復檢測3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 膀胱測壓和膀胱質量變化

與假手術組相比，3組脊髓橫斷大鼠的DO頻率和幅度均顯著增加(P<0.01)，且膀胱容量顯著減小(P<0.05)(圖1，表1)。LV-shTGF-β1組DO的頻率和幅度較T10脊髓橫斷組或LV-vector組均顯著減少(P<0.01)，且膀胱容量均顯著增加(P<0.01)(圖1，表1)。3組脊髓橫斷大鼠的膀胱質量和膀胱質量/體質量均較假手術組顯著增加(P<0.01)。LV-shTGF-β1組膀胱質量和膀胱質量/體質量較T10脊髓橫斷組或LV-vector組均顯著減少(P<0.05)(表1)。

圖1 膀胱測壓的示例

表1 膀胱測壓參數和膀胱質量變化

2.2 逼尿肌纖維化變化

與假手術組相比，3組脊髓橫斷大鼠的逼尿肌間質組織百分比均顯著增加(P<0.01)(圖2)。LV-shTGF-β1組間質組織百分比較T10脊髓橫斷組或LV-vector組均顯著減少(P<0.05)(圖2)。

A.bladder slides with HE and Masson staining; B.levels of interstitial tissue in the HE staining; *P<0.01 compared with sham group; #P<0.05 compared with T10 transection or LV-vector group

2.3 逼尿肌TGF-β1表達的變化

與假手術組相比，3組脊髓橫斷大鼠的逼尿肌TGF-β1表達均顯著增加(P<0.01)(圖3)；LV-shTGF-β1組TGF-β1表達較T10脊髓橫斷組或LV-vector組均顯著減少(P<0.05)(圖3)。Western blot檢測TGF-β1蛋白表達(圖4，表2)和RT-qPCR法檢測TGF-β1 mRNA表達(表2)，其結果與免疫組化法均類似。

表2 Western blot和RT-qPCR檢測TGF-β1表達的變化

A.bladder slides with TGF-β1 immunohistochemistry; B.levels of TGF-β1 expression;*P<0.01 compared with sham group; #P<0.05 compared with T10 transection or LV-vector group

圖4 Western blot檢測TGF-β1表達

3 討論

SCI的患病率在世界上高達(236～1 298)/100萬人[5]，多達95%的患者存在NB，僅有不到1%患者出院時膀胱功能能夠完全恢復[6]。對骶上SCI患者，抑制DO和改善膀胱纖維化，能夠降低逼尿肌壓和增加膀胱容量，從而改善患者的排尿異常和保護腎功能。

M受體阻滯劑和A型肉毒毒素常用于神經源性DO 的治療[7]，但是，抑制膀胱TGF-β1表達能否抑制DO尚無研究。在脊髓發育不良的神經源性DO兒童，有腎臟瘢痕或逼尿肌漏尿點壓較高(>40 cmH2O)的患者，尿中TGF-β1含量顯著增加[8]，且A型肉毒毒素膀胱壁注射后，其含量顯著降低[9]。在原代培養的逼尿肌細胞，通過RNA干擾，LV-shTGF-β1載體能夠減少57% TGF-β1的表達[3]。本研究發現，LV-shTGF-β1載體能夠通過減少膀胱TGF-β1表達而抑制SCI大鼠的DO。該作用機制不清，不能除外基因治療影響了膀胱壁乙酰膽堿信號傳導，或是它減輕了膀胱纖維化，從而進一步影響膀胱功能。

膀胱纖維化的典型病理特征是：逼尿肌肌束內和肌束間過多的間質組織沉積[10]，通常伴有逼尿肌細胞的肥大/萎縮和膀胱質量的增加[11]。但是，目前膀胱纖維化尚無有效的治療措施[12]。TGF-β1能夠誘導纖維細胞-成肌纖維細胞的轉化和細胞間質的生成，在人類肝臟、肺、心臟和腎纖維化疾病中起重要的促進作用[13]。在原代培養的人類逼尿肌細脆骨，TGF-β1能使細胞變肥大以及增加細胞外的基質[14]。在SCI大鼠，膀胱組織的TGF-β1 mRNA含量顯著增加[15]。本研究發現，利用LV-shTGF-β1膀胱壁注射抑制膀胱TGF-β1表達，能夠減輕SCI大鼠的膀胱質量和減少逼尿肌的間質沉積。

綜上所述，在T10脊髓橫斷大鼠，膀胱壁注射LV-shTGF-β1能夠通過減少膀胱TGF-β1表達而抑制DO和改善膀胱纖維化。該研究可能為NB的治療提供新的思路。