LINC00607通過抑制miR-372影響A549/DDP細胞的增殖和凋亡

楊汶川，韓 東，楊 帆

(臨沂市第三人民醫(yī)院，山東 臨沂 276004)

肺癌(lung cancer)是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的85%，以順鉑(dichlorodiammine platinum，DDP)為基礎的聯(lián)合化學藥物治療(簡稱化療)是晚期NSCLC的重要治療手段[1]。然而，順鉑耐藥是影響化療效果、導致治療失敗的主要原因。因此，了解NSCLC細胞的化療耐藥機制，制定有效治療方案、提高生存率至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA，具有多種功能和復雜的調(diào)控機制，參與了包括所有細胞增殖、凋亡和化療耐藥在內(nèi)的多種生理或病理過程。LINC00607(long intergenic non-coding RNA00607)位于染色體2q35位點，肝癌中LINC00607表達降低，上調(diào)其表達可抑制肝癌細胞增殖，增加細胞凋亡和對阿霉素、5-氟嘧啶的敏感性[2]。肺腺癌中LINC00607表達下調(diào)可能與肺癌進展有關(guān)[3]。miR-372屬于miR-371～373簇，研究顯示miR-372上調(diào)與胃癌細胞DPP耐藥有關(guān)，下調(diào)miR-372可抑制耐藥胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，降低DDP耐藥性[4]。序列分析發(fā)現(xiàn)miR-372是LINC00607的潛在靶序列，miR-372已被證實與NSCLC細胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。本研究通過分析NSCLC組織、人肺腺癌順鉑耐藥細胞系A549/DDP中LINC00607、miR-372表達水平，探討恢復其表達對A549/DDP細胞增殖和凋亡的影響，以期為臨床DDP耐藥NSCLC的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞及試劑：人肺腺癌細胞系A549和順鉑耐藥細胞系A549/DDP(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；DDP(Sigma-Aldrich公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；LipofectamineTM2000、cDNA第一鏈合成試劑盒、Trizol試劑盒和SYBR Green Masker Mix(Invitrogen公司)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia公司)；miR-372模擬物(miR-372 mimics)及其陰性對照(miR-NC)、LINC00607過表達載體(pcDNA3.1-LINC00607)及其陰性對照(pcDNA3.1)、雙熒光素酶報告載體(上海吉瑪制藥公司)；放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氫光熒光素(annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；兔源Ki67抗體、兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase-3)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase，GAPDH)抗體(上海艾博抗生物技術(shù)公司)。

1.1.2 組織來源：收集2016年1月至2018年1月于山東省臨沂市第三人民醫(yī)院確診并進行手術(shù)切除的24例NSCLC組織和相應癌旁組織(距離癌灶大于5 cm)。其中男性15例，女性9例。患者年齡35～78歲，中位年齡67歲。所有患者術(shù)前未接受放射治療或化療。研究經(jīng)本院倫理委員會批準(倫理審批號:20160003)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的分組和處理：A549細胞、A549/DDP細胞采用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中A549/DDP細胞培養(yǎng)液中間斷添加終濃度為1 μg/mL的DDP以維持細胞的耐藥性。實驗前48 h更換為不含DDP細胞培養(yǎng)基。將對數(shù)期A549/DDP細胞接種6孔板，利用LipofectamineTM2000待細胞50%匯合時更換不含血清培養(yǎng)基進行細胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將A549/DDP細胞分為pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-LINC00607組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00607)、(pcDNA3.1-LINC00607+miR-NC)組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00607和miR-NC)、和(pcDNA3.1-LINC00607+miR-372)組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00607和miR-372 mimics)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00607和miR-372表達：按照Trizol使用說明書提取肺癌組織、癌旁組織、A549細胞、A549/DDP細胞的總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用SYBR Green Masker Mix試劑2-ΔΔCt法檢測LINC00607和miR-372的相對表達水平。引物序列：LINC00607上游5′-ATGC CCTCTGTGCTGAAACT-3′，下游5′-TAATGGTGGTGG TGGAAACC-3′；GAPDH上游5′-CAGGAGGCATTG CTGATGAT-3′，下游5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；miR-372上游5′-TCGACAAAGTGCTGCGACATT T-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；U6上游5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，下游5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力：按照1×104個/孔，將各轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞接種96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h后，按每20 μL加入MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡上清液，按每孔150 μL加入二甲基亞楓(DMSO)于搖床上振蕩10 min，空白孔調(diào)零后，酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%

1.2.4 集落形成實驗檢測集落形成數(shù)：按照2×102個/孔，每孔5 mL將各轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞接種到直徑為60 mm的平板，輕輕晃動平板使細胞分散均勻。常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液1次，當出現(xiàn)的肉眼可見的集落時，棄去細胞培養(yǎng)液，進行多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色。流水傳給你去染液，干燥后，計數(shù)細胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 流式細胞測量術(shù)檢測細胞凋亡：收集5×105個各轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞重懸于500 μL的1×結(jié)合緩沖液中，依次加入annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，避光反應15 min后混勻，流式細胞測量術(shù)檢測細胞凋亡。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測cleaved-caspase-3和Ki67蛋白表達：用RIPA裂解緩沖液提取各轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。按照每組30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，常規(guī)濕法將電泳分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h，將膜與一抗(1∶500)在4 ℃下孵育過夜，洗膜后與二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h。加入化學發(fā)光顯色試劑暗室顯色后，以GAPDH為內(nèi)參，圖形處理軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩⒑衜iR-372結(jié)合位點的LINC00607野生(WT)序列或含有miR-372結(jié)合位點的LINC00607突變(MUT)序列克隆到雙熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建雙熒光素酶報告質(zhì)粒載體WT-LINC00607和MUT-LINC00607。將WT-LINC00607、MUT-LINC00607分別與miR-372 mimics、miR-NC分別共轉(zhuǎn)染到A549/DDP細胞，轉(zhuǎn)染48 h，測定各組A549/DDP細胞相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LINC00607和miR-372在肺癌組織中的表達

與癌旁組織比較，肺癌組織中LINC00607表達顯著降低，miR-372表達顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 LINC00607和miR-372在肺癌組織中的表達

2.2 LINC00607和miR-372在A549和A549/DDP細胞中的表達

與A549細胞比較，A549/DDP細胞中LINC00607表達顯著降低，miR-372的表達顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 LINC00607和miR-372在A549細胞和A549/DDP細胞中的表達

2.3 LINC00607對A549/DDP細胞增殖及凋亡的影響

與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00607組A549/DDP細胞LINC00607表達顯著升高，而miR-372表達顯著降低，細胞存活率、集落形成數(shù)、Ki67蛋白表達顯著降低，而凋亡率、cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖1，表3)。

表3 LINC00607對A549/DDP細胞增殖和凋亡的影響

圖1 LINC00607對A549/DDP細胞凋亡(A)及cleaved-caspase-3、Ki67蛋白表達(B)的影響

2.4 LINC00607靶向miR-372

序列分析發(fā)現(xiàn)LINC00607與miR-372之間存在理論結(jié)合位點(圖2)。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-372 mimics和WT-LINC00607共轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞的相對熒光素酶活性與miR-NC和WT-LINC00607共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(P<0.05)；miR-372 mimics和MUT-LINC00607共轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞的相對熒光素酶活性與miR-NC和MUT-LINC00607共轉(zhuǎn)染組比較無顯著變化(表4)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 LINC00607靶向miR-372

2.5 miR-372對LINC00607作用的A549/DDP細胞增殖凋亡的影響

與(pcDNA3.1-LINC00607+miR-NC)組比較，(pcDNA3.1-LINC00607+miR-372)組A549/DDP細胞miR-372表達顯著升高，細胞存活率、集落形成數(shù)、Ki67蛋白表達顯著升高，凋亡率、cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖3,表5)。

圖3 miR-372對LINC00607作用的A549/DDP細胞凋亡(A)及cleaved-caspase-3、Ki67蛋白表達(B)的影響

表5 miR-372對LINC00607作用的A549/DDP細胞增殖凋亡的影響

3 討論

DDP通過誘導DNA損傷、干擾DNA修復發(fā)揮抗腫瘤作用，廣泛用于NSCLC、胃癌、卵巢癌等腫瘤的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的異常表達與NSCLC的DDP耐藥有關(guān)，如lncRNA AK001796、X染色體失活基因(X chromosome inactivation，XIST)在A549/DDP細胞中表達增加，恢復lncRNA表達水平通過降低細胞活力、抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、阻滯細胞周期、誘導凋亡可提高其對DDP的敏感性[6-7]。LINC00607已被證實在肺腺癌組織中表達下調(diào)，且LINC00607低表達與肝癌術(shù)后復發(fā)、化療耐藥相關(guān)[2-3, 8]。因此，LINC00607在NSCLC細胞DDP耐藥中的作用值得探討。

本研發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中LINC00607表達顯著降低，A549/DDP細胞中LINC00607表達較A549細胞顯著降低，說明LINC00607低表達可能與NSCLC細胞DDP耐藥有關(guān)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00607上調(diào)LINC00607表達顯著抑制A549/DDP細胞增殖，促進細胞凋亡。Ki67是與細胞分裂有關(guān)的核抗原，其表達水平高提示細胞增殖活躍、惡性程度較高，Ki67表達水平影響臨床治療療效[9]。Cleaved-caspase-3是細胞凋亡的最終執(zhí)行者，其活化可直接降解細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，導致細胞不可逆凋亡[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)LINC00607表達顯著抑制Ki67蛋白表達，促進cleaved-caspase-3表達，與功能分析結(jié)果一致，表明上調(diào)LINC00607可抑制A549/DDP細胞增殖，誘導細胞凋亡，具有抑癌作用。

多項研究表明，lncRNA通過與miRNA相互作用參與調(diào)控NSCLC細胞增殖、凋亡、耐藥等生命進程。例如，敲減lncRNA XIST通過上調(diào)miR-144-3p可減少A549/DDP細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制耐藥基因的表達，調(diào)控NSCLC細胞的化學藥物敏感性[12]。miR-372已被證實參與多種腫瘤進展。研究顯示，miR-372高表達促進NSCLC細胞增殖，增加侵襲潛能[13]。此外，沉默miR-372通過上調(diào)ZBTB7A激活TRAIL-R2還可以使口腔鱗狀細胞癌對DDP敏感[14]。然而，LINC00607是否通過調(diào)控miR-372表達參與NSCLC細胞DDP耐藥尚未被研究。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中miR-372表達升高，A549/DDP細胞中miR-372表達顯著高于A549細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-372是LINC00607的靶基因，且上調(diào)LINC00607能夠降低miR-372表達水平。此外，上調(diào)miR-372表達還能夠逆轉(zhuǎn)上調(diào)LINC00607對A549/DDP細胞增殖和凋亡的影響，這進一步說明LINC00607通過下調(diào)miR-372參與調(diào)控NSCLC的DDP敏感性。

綜上所述，LINC00607通過下調(diào)miR-372表達可抑制A549/DDP細胞增殖，誘導細胞凋亡，與NSCLC的順鉑耐藥有關(guān)。LINC00607/miR-372分子軸有望成為NSCLC細胞DDP增敏靶點。