多肽P7對(duì)腫瘤組織的靶向識(shí)別與Hsp90表達(dá)水平相關(guān)

孔德欣，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系，北京 100005)

惡性腫瘤是目前全球主要的死因之一[1]。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2020年全球新發(fā)癌病例為1 930萬(wàn)，癌死亡病例近1 000萬(wàn)，預(yù)計(jì)2040年全球癌癥負(fù)擔(dān)將達(dá)到2 840萬(wàn)例，比2020年增加了47%[2]，如此高的發(fā)病率和病死率說(shuō)明目前癌診治仍然面臨很大的挑戰(zhàn)。熱休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)作為細(xì)胞中重要的分子伴侶蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控多種蛋白的成熟與穩(wěn)定，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得了靶向多肽P7(LPLTPLP)，能特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面及細(xì)胞內(nèi)的Hsp90。本研究應(yīng)用多器官腫瘤與邊緣組織組合芯片，分別通過(guò)免疫組化和免疫熒光染色法分析不同腫瘤組織及癌旁組織Hsp90的表達(dá)水平以及FITC-P7對(duì)其的識(shí)別效果，并對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)了P7是腫瘤靶向識(shí)別的優(yōu)異配體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例:多器官組織芯片(X096Mc01)購(gòu)自中科光華智能生物科技有限公司，共包括16種器官腫瘤及匹配或不匹配的邊緣或癌旁組織(食道、胃、結(jié)腸、直腸、肝、肺、腎、乳腺、宮頸、卵巢、膀胱、淋巴結(jié)、皮膚、腦、前列腺、胰腺)，共計(jì)48例不同癌癥患者組織標(biāo)本，其中男26例, 女26例, 年齡范圍在36～82歲，平均年齡為57.8歲(中位數(shù)56.5歲)。按WHO病理分級(jí)，包括Ⅰ期9例、Ⅱ期9例、Ⅲ-Ⅳ期17例；依據(jù)AJCC第7版制定的標(biāo)準(zhǔn)，除無(wú)臨床分期的病例，該芯片包括1期5例、2期25例、3期4例；按TNM分期，包括T1-T2期18例、T3-T4期21例；該芯片包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例12例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例27例，所有病例均無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。

1.1.2 試劑與材料:兔抗人Hsp90單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)；通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；檸檬酸抗原修復(fù)液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；FITC-P7(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司定制)；其他試劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色法:采用免疫組化方法檢測(cè)Hsp90表達(dá)：組織芯片脫蠟水化，檸檬酸抗原修復(fù)液于97 ℃修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫，10%血清封閉，孵育一抗4 ℃過(guò)夜，參照通用型免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。分別于4倍和40倍物鏡下觀察Hsp90在腫瘤與癌旁組織中表達(dá)情況。鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、清晰、定位明確、胞質(zhì)或胞核為棕黃色可判斷為Hsp90染色陽(yáng)性。在40倍物鏡下，組織芯片的每個(gè)點(diǎn)任選3個(gè)視野拍照，用IPP 6.0軟件通過(guò)宏操作進(jìn)行吸光度分析。測(cè)定每個(gè)組織點(diǎn)特定區(qū)域的面積(area)和積分吸光度(integrated absorbance，IA)，并按以下公式計(jì)算各點(diǎn)的平均光密度：平均吸光度=SUM(IA)/SUM(area)，表示該組織點(diǎn)的Hsp90表達(dá)測(cè)量值。

1.2.2 免疫熒光染色法：采用免疫熒光染色法檢測(cè)FITC-P7對(duì)不同腫瘤組織及癌旁組織的識(shí)別效果：組織芯片脫蠟水化，0.3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，10%血清封閉，TBS預(yù)孵育30 min，F(xiàn)ITC-P7避光孵育90 min后封片，于熒光顯微鏡下觀察。在20倍物鏡下，組織芯片的每個(gè)點(diǎn)任選3個(gè)視野拍照，用 IPP 6.0軟件通過(guò)宏操作進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量分析。測(cè)定每個(gè)組織點(diǎn)特定區(qū)域的面積(area)和積分吸光度(IA)，并按以下公式計(jì)算各點(diǎn)的平均光密度：平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)=SUM(IA)/SUM(area)，表示該組織點(diǎn)的P7識(shí)別測(cè)量值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 兩組間差異采用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)性分析；Pearson相關(guān)性系數(shù)定義：0.9

2 結(jié)果

2.1 Hsp90在不同腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)水平

組織芯片樣本包括16種器官腫瘤及匹配或不匹配的邊緣或癌旁組織(食道、胃、結(jié)腸、直腸、肝、肺、腎、乳腺、宮頸、卵巢、膀胱、淋巴結(jié)、皮膚、腦、前列腺、胰腺)，每種器官腫瘤及邊緣或癌旁組織各3點(diǎn)。免疫組化染色后的陣列排列見(jiàn)圖1A。在48例不同組織腫瘤及癌旁組織中，腫瘤組織的Hsp90表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)(圖1B)。食管、腎、宮頸、腦的代表性免疫組化圖像見(jiàn)圖1C。分別比較16種不同腫瘤及相應(yīng)癌旁組織的Hsp90表達(dá)水平，除直腸與皮膚組織外，所有腫瘤組織較癌旁組織均表現(xiàn)出Hsp90升高的趨勢(shì)，其中腦、子宮頸、食管、腎、肺、卵巢、前列腺、胃的腫瘤組織表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織(P<0.05)(圖2)。

A.tissue array arrangement diagram (×40), a1-3,a4-6,a7-9,a10-12,c1-3,c4-6,c7-9,c10-12,e7-9,e10-12,g1-3,g4-6,g7-9,g10-12 were cancer tissues of esophagus, stomach, colon, rectum, liver, lung, kidney, breast, cervix, ovary, bladder, lymph gland, skin, brain prostate and pancreas, b1-3,b4-6,b7-9,b10-12,d1-3,d4-6,d7-9,d10-12,f1-3,f4-6,f7-9,f10-12,h1-3,h4-6,h7-9,h10-12 were para-carcinoma tissues of esophagus, stomach, colon, rectum, liver, lung, kidney, breast, cervix, ovary, bladder, lymph gland, skin, brain, prestate and pancreas; B.overall expression levels of Hsp90 in 16 types of tumor tissues and para-carcinoma tissues; C. expressions of Hsp90 in 4 cases of typical pathological specimens; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group

A-P.difference of Hsp90 expression between tumors and para-carcinoma tissues in bladder, brain, breast, cervix, colon, esophagus, kidney, liver, lung, lymph gland, ovary, pancreas, prostate, rectum, skin, stomach. The expression levels of HSP90 in brain, cervix, esophagus, kidney, lung, ovary, prostate, stomach tumors were significantly higher than that in para-carcinoma tissues; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group

2.2 FTTC-P7對(duì)不同腫瘤及癌旁組織的識(shí)別效果

根據(jù)40倍物鏡下拍攝的熒光圖像及定量數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示FITC-P7對(duì)所有類(lèi)型的腫瘤及相應(yīng)癌旁組織的識(shí)別效果無(wú)顯著性差異(圖3A)。食管、腎、宮頸、腦的代表性免疫熒光圖像見(jiàn)圖3B。在16種腫瘤類(lèi)型中，腦、乳腺、結(jié)腸、食管、宮頸、淋巴結(jié)、胰腺、前列腺、直腸的腫瘤組織較癌旁組織表現(xiàn)出更高的FITC-P7染色水平，其中乳腺癌的腫瘤識(shí)別水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)(圖4)。

A.overall recognition effect of P7 in 16 types of tumor tissues and para-carcinoma tissues; B.fluorescence intensity of tumor tissues and para-carcinoma tissues of esophagus, kidney, cervix, brain; MFI.mean fluorescence intensity

A-P.the recognition effects of FITC-P7 between tumors and para-carcinoma tissues in bladder, brain, breast, cervix, colon, esophagus, kidney, liver, lung, lymph gland, ovary, pancreas, prostate, rectum, skin, stomach; FITC-P7 preferably recognized tumor tissues in brain, breast, colon, esophagus, cervix, lymph gland, pancreas, prostate and rectum compared with respective para-carcinoma tissues; the breast cancer showed a significant prominent FITC-P7 staining; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group; MFI.mean fluorescence intensity

2.3 P7對(duì)腫瘤的識(shí)別效果與Hsp90表達(dá)水平的相關(guān)性分析

所有腫瘤組織的綜合分析表明，在腫瘤組織中，隨著Hsp90表達(dá)水平的升高，P7對(duì)腫瘤的識(shí)別效果更強(qiáng)，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示二者具有中度相關(guān)性(r=0.5147，P<0.01)。

3 討論

Hsp90是細(xì)胞內(nèi)重要的分子伴侶蛋白，調(diào)節(jié)400多種客戶蛋白的構(gòu)象成熟及其穩(wěn)定性。抑制 Hsp90 能夠影響多條信號(hào)通路，其是重要信號(hào)通路“節(jié)點(diǎn)”[5]，也是抗腫瘤藥物研發(fā)重要靶點(diǎn)[6]。除細(xì)胞內(nèi)定位外，Hsp90已被發(fā)現(xiàn)定位于多種惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜上，介導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[7]。雖然Hsp90在所有細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，但在非腫瘤組織細(xì)胞膜上幾乎不表達(dá)，因而使其成為腫瘤靶向的優(yōu)異靶點(diǎn)。

P7是本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的具有Hsp90靶向與抑制雙重功能的多肽，實(shí)驗(yàn)證實(shí)P7能特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面及細(xì)胞內(nèi)Hsp90[10]。本研究通過(guò)免疫組化染色法對(duì)48例16種器官腫瘤及匹配或不匹配的邊緣或癌旁組織Hsp90表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Hsp90呈現(xiàn)高表達(dá)，而在邊緣或癌旁組織中表達(dá)量較低。此外，通過(guò)熒光染料FITC標(biāo)記的FITC-P7，定量檢測(cè)了多肽P7對(duì)不同腫瘤及癌旁組織的識(shí)別效果，結(jié)果FITC-P7對(duì)腫瘤組織和癌旁組織的識(shí)別效果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但總體對(duì)腫瘤組織的識(shí)別能力更強(qiáng)。為了進(jìn)一步證實(shí)P7對(duì)腫瘤的靶向能力與Hsp90表達(dá)水平的關(guān)系，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者具有中度相關(guān)性。由于組織芯片無(wú)法區(qū)分膜蛋白及胞質(zhì)蛋白，無(wú)法定量檢測(cè)細(xì)胞表面Hsp90蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞膜FITC-P7染色，因而胞質(zhì)蛋白可能會(huì)對(duì)癌旁與癌組織的Hsp90蛋白表達(dá)差異以及P7的特異性識(shí)別造成一定干擾。采用活組織或活細(xì)胞進(jìn)行特異性細(xì)胞表面Hsp90蛋白與FITC-P7染色檢測(cè)將可能獲得更為精準(zhǔn)的結(jié)果，有待后續(xù)研究。綜上所述，本研究表明P7是腫瘤靶向識(shí)別的優(yōu)異配體，以P7為配體開(kāi)發(fā)新型靶向治療和診斷策略將具有較好臨床前景。