氫氧化鈉增強雷帕霉素抑制Tsc2缺失的小鼠胚胎成纖維細胞的增殖

李 凱，王亞南

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生理學系，北京 100005)

結節性硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)是一類影響全身多器官的遺傳病，疾病表現為患者的腎臟、腦、皮膚、心臟等器官可自發形成腫瘤，并常伴隨有神經方面疾病如癲癇，等等。TSC1/2缺失或突變導致的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)過度活化是TSC的主要發病機理。目前TSC患者的治療主要是通過長期服用mTOR抑制劑——如西羅莫司和依維莫司——抑制mTOR活性，進而控制如自發瘤的形成等病癥的進展[1]。

mTOR信號通路在腫瘤的發生發展中一直扮演著一個重要的角色。由于mTOR可以通過多種方式感應并整合激素、葡萄糖、氨基酸等多種信號，進而調控細胞的增殖、分化、自噬、能量代謝和蛋白合成等多種細胞必不可少的生命過程[2]。因此，腫瘤的發生發展與該通路有著密切關系。

多數腫瘤細胞處于一種代謝異常狀態，即便在有氧狀態下也會以糖酵解作為主要供能手段，這稱之為“瓦博格效應(Warburg effect)”。有氧糖酵解帶來的影響之一是細胞內乳酸的堆積。堆積的乳酸通過細胞排出，導致腫瘤微環境pH值下降[3]。前期研究發現，mTOR通過上調PKM2的表達促進腫瘤細胞的有氧糖酵解[4]，所以mTOR的過度活化與細胞的異常代謝以及細胞外pH降低有所關聯。而腫瘤的酸性微環境為腫瘤的發生發展提供多種便利，包括增加其侵襲轉移能力等[5-6]。調節腫瘤的酸性微環境已經被證實有利于腫瘤的治療[7-8]。

由于在TSC與腫瘤中均有mTOR過度活化的情況，而調節酸性環境有利于腫瘤的治療。一個值得探討的問題就是調節酸性環境是否有利于TSC的治療。

因此，本研究利用Tsc2缺失(Tsc2-null,Tsc2-/-)小鼠的胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)來建立TSC的細胞模型，模擬TSC患者細胞中mTOR過度活化的狀態；通過改變細胞所處微環境的酸堿度，研究其對雷帕霉素的敏感程度的變化，以期為TSC的治療提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：Tsc2-/-小鼠胚胎成纖維細胞系(Tsc2-/-細胞)及其對照的野生型細胞系(wildtype, WT細胞)(本實驗室保存，參照已有描述[9])。

1.1.2 主要試劑：DMEM-高糖培養基(Corning公司)；胎牛血清和EDTA-0.25% 胰蛋白酶(Gibco公司)；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Ameresco公司)；氫氧化鈉(NaOH)(北京化工廠)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)和羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)(Sigma-Aldrich公司)；多聚甲醛和結晶紫(武漢塞維爾公司)；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技公司)；β-actin 抗體(Santa Cruz公司);核糖體蛋白S6抗體、磷酸化核糖體蛋白S6(Ser235/236) 抗體、磷酸化4E-BP1(Thr37/46) 抗體(CST公司)；山羊抗小鼠和山羊抗兔熒光IgG二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：將Tsc2-/-細胞及WT細胞培養于含10 mmol/L HEPES和10% 胎牛血清的DMEM-高糖培養基中，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。光學顯微鏡下觀察細胞匯合度達到90% 時，利用EDTA-0.25% 胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 實驗的分組：將Tsc2-/-細胞及WT細胞分為：對照組、氫氧化鈉(15 μmol/L NaOH)處理組、雷帕霉素(10 nmol/L Rapa)處理組、氫氧化鈉和雷帕霉素聯合(15 μmol/L NaOH + 10 nmol/L Rapa)處理組。各組藥物濃度均為終濃度。對照組與Rapa組培養基的pH值為7.4;NaOH組和Combo組培養基的pH值為8.4。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：將Tsc2-/-細胞及WT細胞培養于96孔板，每孔接種2 000個細胞，分別在藥物處理0、24、48、72 h后加入MTT，每組每個時間點各設置5個復孔，檢測各孔在570 mm波長的吸光度(A)值，經過計算后獲得各個時間點的差異倍數(fold change)并繪制生長曲線。

1.2.4 克隆形成實驗：將Tsc2-/-細胞及WT細胞各300個接種于6孔板中，充分分散后按照藥物分組處理7 d。在光學顯微鏡的100倍視野下看到單個群落填充滿視野后，經多聚甲醛固定，使用結晶紫染色，之后拍照、計數。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期：細胞經藥物處理24 h后，胰蛋白酶消化，用預冷的70% 乙醇固定，進行碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色，通過C6流式細胞儀檢測細胞所處周期的比例，用FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.6 免疫印跡法檢測蛋白：細胞培養在6孔板中，按照分組給予藥物處理48 h后提取蛋白，進行SDS-PAGE、轉膜和封閉。加入對應一抗后4 ℃過夜。第2天加入二抗，室溫孵育2 h。在Odyssey CLX雙色紅外激光成像系統中顯影，并獲取圖像。利用Fiji軟件測算圖像上條帶的灰度值，進而計算蛋白相對表達量(以β-actin為內參)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 氫氧化鈉聯合雷帕霉素抑制Tsc2-/- 細胞的增殖

在NaOH組中，Tsc2-/-細胞的增殖能力顯著低于對照組(P<0.05)。在Rapa組中，WT細胞和Tsc2-/-細胞的增殖能力均顯著低于對照組(P<0.05)。在Combo組中，WT細胞和Tsc2-/-細胞增殖能力顯著低于NaOH組和Rapa組(P<0.05)。在Rapa組和Combo組中，Tsc2-/-細胞的增殖能力顯著低于WT細胞(P<0.05)(圖1)。在NaOH組和Rapa組中，WT細胞和Tsc2-/-細胞的克隆形成數量均顯著低于對照組(P<0.05)。在Combo組中，WT細胞和Tsc2-/-細胞的克隆形成數量顯著低于NaOH組和Rapa組(P<0.05)。在Rapa組和Combo組中，Tsc2-/-細胞的克隆形成數量顯著低于WT細胞(P<0.05)(圖2)。

A.growth curves of WT and Tsc2-/- cells in different treatments; B.fold change of 72 hours comparing to 0 hour in same cell line with different treatments; *P<0.05 compared with control group in same cell line; #P<0.05 compared with Rapa group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line; ▽P<0.05 compared with WT cells in same treatment

A.photos of colony formation of Tsc2-/- and WT cells in different treatments; B.bar chart represents the number of colonies in different treatments and cell lines; *P<0.05 compared with Control group in same cell line; #P<0.05 compared with Rapa group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line; ▽P<0.05 compared with WT cells in same treatment

2.2 氫氧化鈉聯合雷帕霉素阻滯Tsc2-/-細胞增殖周期

與對照組相比，在NaOH組和Rapa組中，僅Rapa組的WT細胞和Tsc2-/-細胞的G1期比例升高 (P<0.05)。Combo組的WT細胞和Tsc2-/-細胞的G1期比例顯著高于NaOH組和Rapa組 (P<0.05)。在Combo組中，Tsc2-/-細胞的G1期比例顯著高于WT細胞 (P<0.05)(圖3，表1)。

表1 氫氧化鈉聯合雷帕霉素將Tsc2-/-細胞阻滯在G1期

Flow cytometric analysis of cell cycle in treated Tsc2-/- and WT cells

2.3 氫氧化鈉不降低mTOR通路中p-S6和p-4EBP1的表達

與對照組相比，Rapa組的WT和Tsc2-/-細胞的p-4EBP1和p-S6蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。NaOH組WT細胞的p-4EBP1和p-S6蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與NaOH組和Rapa組相比，Combo組的p-4EBP1和p-S6蛋白表達水平只顯著低于NaOH組(P<0.05)(圖4)。

A.Western blot was used to analyze S6, p-S6 and p-4EBP1 expression levels in Tsc2-/- and WT cells; B-D.relative protein expression levels of S6 (B), p-4EBP1 (C), and p-S6 (D); *P<0.05 compared with control group in same cell line; △P<0.05 compared with NaOH group in same cell line

3 討論

結節性硬化癥(TSC)是一種常染色體顯性遺傳病，6 000～10 000名新生兒中就有1位患兒，約90% 的患者伴隨著TSC1/2基因突變。目前一種有效療法是長期服用雷帕霉素衍生物如西羅莫司和依維莫司，來抑制TSC1/2失活突變導致的mTOR過度活化[1]。在依維莫司的臨床實驗中，治療TSC患者血管肌脂瘤的有效率是42%[10]。而在使用依維莫司輔助治療TSC患者癲癇的臨床實驗中，有效率則在40% 以下[11]。這表明雷帕霉素的抑制效果依然有限， 并且尚無能有效替代雷帕霉素的療法。因此需要找到新的一種療法，以增強雷帕霉素的作用。

細胞代謝改變是腫瘤細胞異于普通細胞的重要特征之一，大多數腫瘤會產生“瓦博格效應”，導致腫瘤微環境的pH下降。且酸性的腫瘤微環境促進了腫瘤的發生發展[5]。前期研究表明，Tsc2缺失導致的mTOR過度活化會上調PKM2的表達，促進“瓦博格效應”的產生[4]。中和腫瘤的酸性微環境可明顯降低腫瘤的惡化程度，減少侵襲轉移[7]，并可改善腫瘤免疫微環境，有利于腫瘤的治療[8]。

那么可否將調節酸性微環境的療法應用于治療mTOR過度活化的TSC患者呢？本研究發現，堿性環境(pH 8.4)中的雷帕霉素能夠有效抑制Tsc2-/-細胞增殖能力。這一結果提示在TSC的細胞模型中，升高細胞外pH值可以增強其對雷帕霉素的敏感性。前期報道表明，雷帕霉素可以使細胞周期阻滯在G1期[12]。本研究發現堿性環境(pH 8.4)中的雷帕霉素可以進一步將細胞周期阻滯在G1期，暗示堿性環境或許通過調節細胞周期來發揮作用。

雷帕霉素控制TSC疾病進程的分子機制是抑制mTOR過度活化。而p-S6和p-4EBP1是mTOR通路下游的標志性分子，其表達高低可以反映mTOR活性的強弱[2]。本研究顯示，Combo組和Rapa組相比，p-S6和p-4EBP1的表達量并無明顯改變。這表明氫氧化鈉并不影響雷帕霉素對mTOR通路的抑制作用。

綜上，堿性環境(pH 8.4)可在不影響雷帕霉素對mTOR信號通路作用的情況下，增強其抑制細胞增殖的效果。在未來的臨床應用中，或許可以聯合使用靶向酸性環境的藥物，在維持現有效果的同時，降低雷帕霉素的劑量，進而減少如免疫抑制、傷口愈合障礙等劑量相關的不良反應，提高患者的生活質量。