白芨多糖上調潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜緊密連接蛋白occludin的表達

李雨芯，余雪嫣，黃 雪

(廣西醫科大學第一附屬醫院 老年病學消化內科，廣西 南寧 530021)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要累及結直腸黏膜與黏膜下層的的慢性、復發性腸道炎性疾病，屬于炎性反應性腸病最常見的一種臨床亞型。UC的發病率呈逐年增長趨勢，現已發展為一種全球性疾病[1]。腸上皮屏障功能障礙是UC重要的致病因素之一[2]。腸上皮屏障受損可引起腸黏膜通透性增加，使病原微生物等通過上皮細胞進入黏膜固有層，誘導腸道炎性和免疫反應。緊密連接是腸上皮屏障最主要的構成部分，對維持腸上皮屏障的功能和完整性至關重要[3]。白芨多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)來源于蘭科植物白芨，具有抗感染、抗潰瘍及體外免疫調節活性等多種藥理作用[4]，且具有自身降解性、局部滯留性、無毒副作用等特性[5]，有潛在的臨床應用前景。BSP治療UC的具體機制尚未詳盡闡明，且無對UC腸上皮屏障作用的相關研究。因此本研究主要探討BSP對葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導的UC小鼠的作用及其對腸黏膜occludin蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質量18～22 g(廣西醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證號SCXK 桂2014-0002)。

藥物及主要試劑：白芨多糖(BSP)(純度70%，上海源葉生物科技有限公司)；DSS(MP Biomedicals公司)；柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine，SASP，上海信誼天平藥業有限公司)；大便隱血測定試劑盒[美利泰格診斷試劑(嘉興)有限公司]；高效RIPA組織快速裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；4%多聚甲醛(北京白鯊易科技有限公司)；兔抗occludin單克隆抗體(Abcam公司)；內參GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)；兔二抗(Earthox公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組與藥物干預：將小鼠隨機分為對照組、DSS模型組(自由飲用2.5% DSS溶液7 d)、SASP陽性對照組(300 mg/kg)以及BSP低(125 mg/kg)和高(250 mg/kg)劑量組，每組6只。BSP的干預劑量參照文獻[6]。從建模開始灌胃給藥，1次/d,連續7 d。

1.2.2 取材及樣本的處理：給藥結束后禁食12 h，腹腔注射4%水合氯醛麻醉并處死。分離肛門至回盲部的腸管，測量結腸長度后，將結腸分成2份，1份置于-80 ℃冰箱用于Western blot實驗，另1份置于4%的多聚甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.3 疾病活動指數(disease adivity index,DAI)評分：每天記錄小鼠的體質量變化、大便性狀及大便隱血/便血情況，并進行DAI評分。評分標準參照文獻[7](表1)。DAI=[體質量下降(%)評分+大便性狀評分+大便隱血/便血評分]/3。

表1 疾病活動指數評分(DAI)

1.2.4 結腸組織形態學觀察和評分：將結腸置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，進行常規HE染色后觀察結腸黏膜形態學變化，并進行組織病理學評分，評分標準參照文獻[8]。

1.2.5 Western blot檢測結腸組織occludin蛋白的表達：提取結腸組織總蛋白并用BCA法測蛋白濃度，12% SDS-PAGE分離后，將蛋白轉至PVDF膜，室溫下封閉1 h。然后置于相應一抗中，4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜，置于二抗中室溫避光孵育1 h。采用Licor Odyssey V3.0軟件掃膜和Image J軟件分析結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 BSP對UC小鼠體質量變化(%)和DAI評分的影響

造模第7天，對照組、DSS模型組、SASP陽性對照組和BSP低、高劑量組小鼠的體質量變化(%)依次為103.8±2.5、83.0±3.7、95.1±0.9、88.5±1.7、91.7±1.3(P<0.05)。與對照組比較，DSS模型組小鼠 DAI 評分顯著升高(P<0.01)。與DSS模型組比較，BSP低、高劑量組小鼠 DAI 評分均降低(P<0.05)(圖1)。

#P<0.01 compared with control group；*P<0.05 compared with model group

2.2 BSP對UC小鼠結腸長度的影響

與對照組比較，DSS模型組小鼠結腸長度顯著縮短(P<0.01)；與DSS模型組比較，BSP低、高劑量組小鼠結腸縮短程度均減輕(P<0.05)(表2)。

2.3 BSP對UC小鼠結腸組織病理學表現和評分的影響

對照組小鼠結腸黏膜上皮結構完整，腺體、隱窩形態正常，排列整齊，偶見炎性細胞浸潤。DSS模型組小鼠結腸黏膜上皮嚴重缺失，腺體、隱窩變形破壞甚至消失，杯狀細胞顯著減少，黏膜和黏膜下層可見廣泛炎性細胞浸潤。BSP低、高劑量組小鼠結腸黏膜損傷程度較DSS模型組均得到不同程度的改善，腺體、隱窩結構破壞、炎性細胞浸潤均有所減輕，杯狀細胞增加(圖2)。與對照組比較，DSS模型組小鼠結腸組織病理學評分顯著升高(P<0.01)；與DSS模型組比較，BSP低、高劑量組小鼠組織病理學評分均降低(P<0.05)(表2)。

圖2 各組小鼠結腸組織病理學表現

2.4 BSP對UC小鼠結腸組織occludin蛋白表達的影響

與對照組比較，DSS模型組小鼠結腸組織緊密連接蛋白occludin表達顯著減少(P<0.01)；與DSS模型組比較，BSP低、高劑量組occludin蛋白表達均顯著增加(P<0.01)(圖3，表2)。

圖3 Western blot檢測結腸組織occludin蛋白的表達

表2 各組小鼠結腸長度、組織病理學評分和結腸組織occludin蛋白相對表達量比較

3 討論

BSP是從傳統中藥白芨塊莖中提取的一種天然高分子黏性多糖，被廣泛應用于食品和藥物的制備，具有潛在的臨床應用前景。BSP可通過減少TNF-α、IL-1β，增加IL-10[9]，抑制炎性反應和氧化應激以及TLR4/NF-κB信號通路的激活[6]，促進UC小鼠結腸黏膜損傷修復和抑制相關免疫反應[10]，進而緩解小鼠結腸炎。本研究發現，BSP能夠顯著改善DSS誘導的UC小鼠的體質量減輕、結腸縮短，修復結腸黏膜損傷和減少炎性細胞浸潤，降低DAI評分和組織病理學評分。且呈劑量依賴性，劑量越高，效果越好。表明BSP可以減輕UC小鼠的炎性反應，對UC小鼠具有顯著的療效。

腸上皮屏障的功能和完整性主要由緊密連接調控[11]。在UC中，緊密連接破壞和緊密連接相關蛋白表達異常被認為是介導腸上皮屏障功能障礙的主要機制[12]。Occludin蛋白是首個被發現的跨膜蛋白，由4個橫跨膜區域、1個細胞內環和2個細胞外環構成，具有封閉相鄰細胞間隙、調節信號傳導分子的聚集以及調控物質的細胞旁轉運等作用。Occludin蛋白在絲氨酸和蘇氨酸殘基上高度磷酸化，通過磷酸化在緊密連接的組裝和通透性中發揮至關重要的作用[13]。Occludin蛋白在UC患者和DSS誘導的UC小鼠結腸組織中均顯著降低，且occludin蛋白的敲除可導致大分子物質的細胞旁通透性增加[14]。因此occludin蛋白的表達量在一定程度上反映了腸上皮屏障通透性和功能的改變。本研究發現，給予2.5% DSS造模后小鼠結腸組織occludin蛋白表達顯著減少，若同時給予BSP干預，occludin蛋白的表達較DSS模型組顯著增多。表明BSP可以上調occludin蛋白的表達，改善腸上皮屏障的功能和完整性。

綜上所述，BSP可以減輕DSS誘導的UC小鼠的結腸炎性反應，其作用機制可能與其上調腸黏膜occludin蛋白的表達，從而保護腸上皮屏障有關。