Ghrelin改善ApoE-/-小鼠心肌梗死后內(nèi)皮功能和斑塊穩(wěn)定性

王 麗，龐 俊，陳慶偉，李桂瓊，柯大智，李興升

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 老年病科，重慶 400010)

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，目前中國每年約有2.3億人罹患心血管疾病，心血管疾病已成為危害人類身體健康的主要疾病之一。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以動脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積和粥樣硬化斑塊形成為主要特征，是心血管疾病死亡的重要原因[1]。AS斑塊破裂和繼發(fā)性血栓形成是導(dǎo)致急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的主要病因[2]，而內(nèi)皮功能紊亂及AS斑塊的不穩(wěn)定是易損斑塊破裂的重要致病原因[3]。

Ghrelin是從大鼠胃黏膜中分離純化的一個含有28個氨基酸的多肽，是生長激素促分泌物受體(growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的內(nèi)源性配體。Ghrelin具有降低血壓[4]、抗感染、抗氧化[5]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[6]、改善心衰[7]、對抗動脈粥樣硬化等[8]多種生物學(xué)效應(yīng)，提示其對心血管系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。然而，ghrelin對易損斑塊合并心肌梗死患者內(nèi)皮功能和斑塊穩(wěn)定性的影響目前尚無報道。在該研究中，通過高脂飲食飼養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠誘導(dǎo)AS易損斑塊，并結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建易損斑塊+急性心肌梗死雙模型，探討ghrelin對雙模型小鼠內(nèi)皮功能和斑塊穩(wěn)定性的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑：Ghrelin、RAM-11和α-actin抗體(Abcam公司)；油紅O(Sigma-Aldrich公司);一氧化氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);Masson染色試劑盒(康為試劑)。高脂飼料：基礎(chǔ)飼料79%+脂肪21%+膽固醇0.15%(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心合成)。

1.1.2 動物：8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠30只，體質(zhì)量26～29 g[北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004]。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將ApoE-/-小鼠分為對照組、雙模型組和ghrelin干預(yù)組。所有ApoE-/-小鼠均高脂飲食喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)AS易損斑塊，構(gòu)建的AS易損斑塊模型即為對照組。在第8周時，雙模型組和ghrelin干預(yù)組結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建急性心肌梗死模型。在急性心肌梗死造模后，ghrelin干預(yù)組腹腔注射ghrelin(100 μg/kg，一天兩次),直至第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 M型超聲檢測小鼠心功能：4周后，用超聲心動圖檢測各組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)(在重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院心臟超聲科完成)。所有測量采用雙盲法，由心臟超聲專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行測定。

1.2.3 血脂及NO水平的測定：超聲檢查后，隔夜禁食采眼眶血，全自動生化分析儀測定血漿三酰甘油(trigly ceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇HDL-C(在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科測定)。Griess法檢測各組小鼠血漿一氧化氮(NO)水平。

1.2.4 形態(tài)學(xué)及免疫組化的檢測：斷頸處死小鼠，仔細(xì)分離心臟和整個腹主動脈，行HE染色和苦味酸天狼猩紅染色，RAM-11及β-actin免疫組化染色檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的分布。用IPP6.0軟件測定主動脈斑塊面積與管腔面積百分比、斑塊內(nèi)脂質(zhì)和膠原的分布。計(jì)算易損指數(shù)=(RAM11+油紅O)染色百分比/(α-actin+天狼猩紅)染色百分比。

1.2.5 Masson染色檢測心肌梗死面積：用Masson染色檢測各組小鼠心肌梗死面積。應(yīng)用IPP 6.0軟件測量并統(tǒng)計(jì)壞死心肌與全部左心室心肌面積的百分比，各組取其平均值。

1.2.6 Real-time PCR和Western blot檢測各組VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)：提取梗死邊緣區(qū)心肌組織RNA，real-time PCR檢測VEGF的mRNA表達(dá)。引物序列如下：VEGF(154 bp)，上游：5′-AG AAGCAGTCCCTGGAGTAGA-3′，下游：5′-TCCGATC TCCAGTTAGCACC-3′；內(nèi)參β-actin(174 bp)，上游：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游：5′-AT GCCACAGGATTCCATACC-3′。反應(yīng)條件：第1次循環(huán)95 ℃ 2 min，其后以95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40周期，最后72 ℃ 5 min終止。目的基因與β-actin的相對比值作為其表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計(jì)算相對比值。

提取梗死邊緣區(qū)心肌組織總蛋白，Western blot檢測VEGF的蛋白表達(dá)。聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白印跡到PVDF膜上。5%脫脂牛奶浸泡封閉1 h，加一抗(anti-VEGF，1∶1 000；β-actin，1∶2 000)4 ℃搖晃過夜，用TBST液洗膜3次。加二抗(1∶1 000)室溫下?lián)u晃2 h。用TBST液洗膜3次。利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行圖像掃描，保存圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、血脂及NO2-/NO3-水平

雙模型組TG較對照組升高不明顯，而ghrelin干預(yù)組卻顯著下降(P<0.05)。雙模型組血清NO2-/NO3-水平顯著低于對照組(P<0.001)，ghrelin干預(yù)后顯著回升雙模型組血清NO2-/NO3-水平(P<0.001)(表1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及血脂變化

2.2 小鼠AS斑塊面積的評估

雙模型組小鼠腹主動脈斑塊表面積、橫斷面面積較對照組升高不明顯，而ghrelin干預(yù)后可明顯減少雙模型組小鼠主動脈斑塊的表面積和橫斷面面積(圖1A～D)(P<0.001)。

A.Oil Red O staining; B.HE staining(×200); C.plaque surface area (%); D.plaque cross sectional area(%); *P<0.001 compared with the control group; #P<0.001 compared with the double model group

2.3 小鼠心功能變化

雙模型組LVEF和LVFS較對照組明顯降低(P<0.01)，ghrelin干預(yù)后使雙模型組LVEF和LVFS顯著回升(圖 2)(P<0.05)。

*P<0.01 compared with the control group; #P<0.05 compared with the double model group

2.4 Ghrelin對各組小鼠粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響

雙模型組斑塊內(nèi)膠原纖維、平滑肌細(xì)胞、脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞的分布、斑塊的易損指數(shù)較對照組升高不明顯，ghrelin干預(yù)后可顯著增加雙模型組斑塊內(nèi)膠原纖維和平滑肌細(xì)胞的分布(P<0.001)，降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞的分布(P<0.001)，減低易損指數(shù)(圖3，表2)(P<0.01)。

表2 各組小鼠腹主動脈斑塊易損指數(shù)的比較

圖3 各組中脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、膠原纖維和平滑肌細(xì)胞的組成

2.5 Ghrelin對各組小鼠心肌梗死面積的影響

雙模型組梗死周邊區(qū)間質(zhì)纖維增生較對照組明顯加重(圖4A)，腹腔注射ghrelin干預(yù)后可見其間質(zhì)纖維的增生較雙模型組明顯減少(圖4A)。IPP6.0計(jì)算各組心肌梗死面積的百分比(直方圖所示，圖4B)。

A.Masson staining(×400); B.myocardial infarction area(%); *P<0.001 compared with the control group; #P<0.001 compared with the double model group; scare bar=250 μm

2.6 各組小鼠VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)

雙模型組心梗周邊區(qū)缺血心肌VEGF的mRNA(圖5A)和蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(圖5B，C)，ghrelin干預(yù)后可顯著增加雙模型組缺血心肌VEGF的mRNA(圖5A)和蛋白表達(dá)(圖5B,C)。

A.relative expression of mRNA; B.Western blot for VEGF; C.relative expression of protein; *P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the double model group

3 討論

AS斑塊破裂和繼發(fā)性血栓形成是導(dǎo)致AMI的主要病因[2]。內(nèi)皮功能紊亂及AS斑塊的不穩(wěn)定是易損斑塊破裂的重要致病原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin及GHSR在左心房、左心室及主動脈、冠狀動脈、微血管內(nèi)皮細(xì)胞均有廣泛表達(dá)[9]，且具有一系列心血管系統(tǒng)保護(hù)作用[4-8]。那么，ghrelin對易損斑塊合并心肌梗死患者內(nèi)皮功能和斑塊穩(wěn)定性的影響及相關(guān)機(jī)制如何，目前尚無研究報道，這將是本課題所要探討的重點(diǎn)內(nèi)容。

ApoE是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白受體的配體，ApoE缺乏則導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)積累，而導(dǎo)致AS病灶的產(chǎn)生[10]。在該研究中，ghrelin可明顯減少雙模型組小鼠主動脈斑塊的表面積和橫斷面面積、降低血漿TG水平，提示ghrelin可通過降低血漿TG水平、縮小斑塊面積延緩易損斑塊合并心肌梗死小鼠AS病變進(jìn)展。NO作為血管內(nèi)皮分泌的血管舒張因子，具有舒張血管、抑制血小板聚集與黏附、抑制細(xì)胞凋亡與增生、抗感染等一系列生物學(xué)效應(yīng)[11]，是預(yù)測冠心病的獨(dú)立危險因素之一[12-13]。Ghrelin可顯著升高雙模型組血清NO水平，提示ghrelin可以顯著改善易損斑塊合并AMI小鼠血管內(nèi)皮損傷、穩(wěn)定AS易損斑塊。

在該研究中，ghrelin干預(yù)后顯著降低了易損斑塊合并AMI小鼠易損指數(shù)、增加了斑塊穩(wěn)定性，減少了二次梗死的可能、改善了臨床此類患者的不良預(yù)后。VEGF是目前已知的功能最強(qiáng)的促有絲分裂素，能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移，在生理性和病理性血管新生過程中發(fā)揮著重要作用[14]。該研究發(fā)現(xiàn)ghrelin可通過上調(diào)VEGF的表達(dá)、從而增加梗死周邊區(qū)心肌微血管生成密度，降低心肌梗死面積，進(jìn)一步提高雙模型組小鼠的心功能，這與上述研究證實(shí)的ghrelin具有促進(jìn)雙模型小鼠心梗周邊區(qū)后血管新生、改善冠脈微循環(huán)的血流灌注是密切相關(guān)的。

綜上所述，該研究結(jié)果首次證實(shí)了ghrelin可改善ApoE敲除小鼠心肌梗死后血管內(nèi)皮功能、促進(jìn)易損斑塊合并心?；颊甙邏K穩(wěn)定性，減少二次梗死發(fā)生、改善患者預(yù)后。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅僅局限于動物的在體實(shí)驗(yàn)研究，究竟ghrelin在人體內(nèi)是否具有相似的作用效果，尚待進(jìn)一步的研究。