參連合用對代謝綜合征患者“腸道菌群-免疫反應”的影響

蔡之幸，陳 越，陳莉莉，李 麗

代謝綜合征（metabolic syndrome, MS）是一組以中心性肥胖、高血壓、糖代謝異常、脂質代謝紊亂等為主要臨床表現的證候群[1]。如不能有效控制，可引發心腦等重要臟器疾病，嚴重威脅人們的生命健康。最新統計數據表明，我國MS發病率已達14%～18%，患者已經超過1億，即每8～10個成年人中就有1人患病[2]。研究發現，腸道菌群不僅影響人體能量代謝[3]，而且在MS發生發展中起著重要作用[4]。通常腸道菌群與腸道黏膜免疫維持動態平衡，一旦腸道內寄生的致病菌大量繁殖，會導致腸道黏膜免疫屏障被破壞，誘發機體免疫反應[5]。MS患者“腸道菌群-免疫反應”目前已成為臨床關注的熱點，但部分研究結論尚存在爭議。本研究擬在前期益氣燥濕法（參連合用）干預MS患者糖脂代謝基礎上[6]，進一步觀察參連聯合常規西醫治療對濕熱中阻兼氣虛型MS患者效果，為探索 “腸道菌群-免疫反應”機制提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取 2019年 1月—2020年 8月上海交通大學醫學院附屬同仁醫院收治的54例濕熱中阻兼氣虛型的MS患者作為研究對象，按照隨機數字表法分為對照組（常規西藥治療）與治療組（常規西藥+參連聯合治療），每組各27例。治療組男16例，女11例，平均年齡（50.64±8.32）歲；對照組男17例，女10例，平均年齡（51.10±8.14）歲。本研究經我院醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合國際糖尿病聯盟于2005年頒布的 MS 診斷標準[7-8]，即腹型肥胖（中國人群男性腰圍≥90 cm，女性腰圍≥80 cm），并具有以下任兩項者①TG≥1.7 mmol/L；②男性HDL＜1.03 mmol/L，女性 HDL＜1.29 mmol/L；③血壓＞130/85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）； ④空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）≥5.6 mmol/L。（2）符合中醫證候辨證標準者。（3）年齡為35～75周歲。

排除標準：（1）妊娠或哺乳期婦女。（2）有嚴重心腦血管及肝腎臟疾病、精神病及其他嚴重器質性疾病患者。（3）納入本研究前1個月應用抗生素、益生菌等微生物制劑的患者。（4） 治療依從性差，不能按療程完成治療者。（5） 治療過程中，出現過敏反應或嚴重不良事件者。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本采集與檢測 收集患者空腹血樣（禁食12 h，次日早晨8∶00采集血樣），標本采集后送檢，通過全自動生化分析儀（日本日立公司生產）測定生化指標，ELISA法（Elascience公司生產）檢測各類炎癥因子。

1.3.2 糞便樣本收集與檢測 采集患者約5 g新鮮糞便中間部分樣本，分裝在2個密閉EP管中，2 h內儲存于-80 ℃冰箱低溫冷凍保存。標本保存后送檢，測定腸道細菌DNA。具體方法如下：取糞便樣本0.2 g制備成腸菌液，采用E.Z.N.A.?soil試劑盒提取糞便基因組DNA，利用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度；采用引物對 V3-V4 可變區進行 PCR 擴增實驗，引物設計合成見表1；反應條件為：采用iQTM SYBR Green Supermix（Bio-Rad，美國）配置定量PCR反應體系，25 μl總體積含 2× Supermix 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl、樣本腸菌液 2 μl、上下游引物（12.5 μmol）各 1 μl。按試劑盒提取說明，每0.2 g 糞便提取 200 μl基因組，計算每克糞便細菌基因組拷貝數，換算為1g copies/g濕便，取對數拷貝數值。

表1 PCR引物設計合成Table 1 PCR primer design and synthesis

1.3.3 治療方法 對照組采用常規西藥艾塞那肽注射液（5 μg/次）治療，于早、晚飯前10 min皮下注射；治療組在對照組治療基礎上加用黃連素片（鹽酸小檗堿片，上海信誼天平藥業有限公司委托上海信誼九福藥業有限公司生產，國藥準字H20034013，規格：0.10 g/片）300 mg，2次/d，每次1片，口服；振源片［吉林吉春制藥股份有限公司，國藥準字Z20093631，規格：0.15 g/片（含人參果皂苷25 mg）］600 mg，3 次/d，每次4片，口服。1周為1個療程，連續觀察2個療程。

1.4 觀察指標 （1）檢測指標：患者治療前后FBG、TC、TG、LDL-C、HDL-C，血清CRP，IL-6、IL-10，乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌屬、腸道總菌等；（2）治療后的各類不良事件。

1.5 統計學處理 使用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料呈正態分布，以±s表示，2組間的比較采用成組t檢驗或校正t檢驗或秩和檢驗。同組內治療前后比較采用配對t檢驗。計數資料以例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。統計推斷的檢驗水準α=0.05（雙側檢驗）。

2 結 果

2.1 2組基線/臨床資料比較 2組患者性別、年齡、肥胖程度、病程及入組前是否服用降脂藥、降壓藥、降糖藥等一般資料比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 2組基線/臨床資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline/clinical data between 2 groups(±s)

表1 2組基線/臨床資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline/clinical data between 2 groups(±s)

注：*.t值

組別 n 性別(男/女)(例)超重/肥胖(例) 年齡(歲) 病程(月) 降脂藥(例)降壓藥(例) 降糖藥(例)對照組 27 16/11 16/11 50.64±8.32 6.81±2.38 22 22 18治療組 27 17/10 15/12 51.10±8.14 7.69±2.17 20 24 20 χ2/t值 0.078 0.076 0.205* 1.420* 0.429 0.147 0.355 P值 0.780 0.783 0.838 0.162 0.513 0.702 0.551

2.2 2組治療前后FBG、TC、TG、LDL-C、HDL-C比較 與治療前比較，2組治療后FBG、TC、TG、LDL-C水平均下降，其中TG下降差異均有統計學意義（P均＜0.05）；HDL-C水平均上升，但差異均無統計學意義（P均＞0.05）。治療組的FBG、TC、TG、LDL-C下降幅度及HDL-C上升的幅度與對照組相比差異均無統計學意義（P均＞0.05）。詳見表2。

表2 2組治療前后FBG、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of FBG, TC, TG, LDL-C, HDL-C between 2 groups before and after treatment(±s, mmol/L)

表2 2組治療前后FBG、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of FBG, TC, TG, LDL-C, HDL-C between 2 groups before and after treatment(±s, mmol/L)

注：*.Uc值

組別 FBG TC TG LDL-C HDL-C對照組(n=27)治療前 7.10±2.08 4.76±0.78 2.26±0.72 3.00±0.68 1.06±0.28治療后 7.06±1.94 4.42±1.04 1.95±0.64 2.95±0.80 1.10±0.22差值 d -0.04±2.77 -0.34±0.93 -0.31±0.40 -0.05±1.08 0.04±0.25配對檢驗t, P值 0.075, 0.941 1.900, 0.069 4.027, 0.000 0.288, 0.652 0.831, 0.414治療組(n=27)治療前 7.12±2.10 4.78±0.82 2.28±0.67 3.02±0.67 1.08±0.27治療后 6.82±1.33 4.44±0.98 1.70±0.78 2.96±0.68 1.10±0.20差值 d -0.30±1.84 -0.34±0.99 -0.58±1.09 -0.06±1.13 0.02±0.18配對檢驗t, P值 0.847, 0.405 0.888, 0.383 2.765, 0.010 0.304, 0.540 0.577, 0.569 2組差值d比較t/Uc值 0.294 0.014 1.115* 0.099 0.236 P值 0.769 0.989 0.265 0.921 0.813

2.3 2組治療前后腸道菌群的比較 與治療前比較，2組治療后乳酸桿菌、雙歧桿菌含量均升高，腸桿菌含量均下降，其中治療組乳酸桿菌含量升高差異有統計學意義（P＜0.05）。治療組的乳酸桿菌、雙歧桿菌含量升高幅度及腸桿菌的下降幅度與對照組相比差異均無統計學意義（P均＞0.05）。腸道總菌治療前后及2組間變化幅度相比差異均無統計學意義（P均＞0.05）。詳見表3。

表3 2組治療前后腸道菌群比較（±s，lg copies/g）Table 3 Comparison of intestinal flora between 2 groups before and after treatment(±s, lg copies/g)

表3 2組治療前后腸道菌群比較（±s，lg copies/g）Table 3 Comparison of intestinal flora between 2 groups before and after treatment(±s, lg copies/g)

注：*.Uc值

組別 乳酸桿菌 雙歧桿菌 腸桿菌屬 腸道總菌對照組(n=27)治療前 4.73±1.20 5.73±1.60 7.09±1.53 7.86±1.09治療后 4.77±1.33 5.77±1.52 7.02±1.70 7.88±1.05差值 d 0.04±2.03 0.04±2.16 -0.07±2.09 0.02±1.18配對檢驗t, P值 0.102, 0.920 0.096, 0.924 0.418, 0.707 0.248, 0.762治療組(n=27)治療前 4.78±1.19 5.75±1.61 7.05±1.52 7.90±0.88治療后 5.68±1.92 6.04±0.80 6.88±0.96 7.85±1.10差值 d 0.90±2.04 0.29±1.57 -0.17±1.42 -0.05±1.82配對檢驗t, P值 2.292, 0.030 0.960, 0.346 0.622, 0.539 0.143, 0.887 2組差值d比較t/Uc值 1.461* 0.540 0.281 0.148 P值 0.144 0.589 0.779 0.882

2.4 2組治療前后血清CRP、IL-6、IL-10水平比較 與治療前比較，2組治療后IL-10水平均上升（P均＜0.05），CRP、IL-6水平均下降，其中IL-6下降差異均有統計學意義（P均＜0.05）。治療組IL-10上升幅度及IL-6下降幅度均大于對照組（P均＜0.05）。詳見表4。

表4 2組治療前后血清CRP、IL-6、IL-10水平比較Table 4 Comparison of serum CRP, IL-6 and IL-10 between 2 groups before and after treatment

3 討 論

MS發病率逐年升高，已經嚴重威脅人類的生命健康。目前，研究發現MS患者體內腸道菌群不僅與人體能量代謝有關，而且與機體免疫反應有著密切關系。在中醫學中，MS散見于“濕阻”“肥胖”“消渴”等，MS與“脾”的關系最為密切[4]，“脾失健運”是MS發生的重中之重[9]。現代研究提示，中醫“脾胃學說”與MS最為密切，“脾胃學說”亦是中醫學中與腸道菌群最直接相關的理論[10-12]。常規西醫藥物治療對于腸道菌群具有重要影響，但參連聯合常規西藥治療對MS患者的腸道菌群及免疫反應的影響目前還尚不完全清楚。基于此，本研究擬納入部分患者，觀察參連聯合常規西醫治療對濕熱中阻兼氣虛型MS患者效果，以期為探索“腸道菌群-免疫反應”機制提供參考。

課題組前期研究發現，以益氣燥濕法為代表的參連合用能有效降低患者糖脂水平，改善患者胰島素抵抗情況[6]。但本研究結果表明，參連聯合常規西醫療法可以使MS患者腸道內乳酸桿菌、雙歧桿菌含量升高，腸桿菌含量下降，其中治療組乳酸桿菌含量升高差異有統計學意義，而腸道總菌含量未見明顯變化。同時，上述療法在降低血糖、血脂方面短期內未見明顯優勢，與前期臨床研究結果[6]不甚相符。其原因可能是參連通過改變患者的腸道菌群結構，進而發揮遠期的調節MS患者糖脂代謝的作用。

腸道菌群是人體最大的微生態系統，負責人體內糖、脂、蛋白質等多種營養物質的代謝與轉化調節，腸道菌群失調可引起低度炎癥，糖脂代謝紊亂會誘發肥胖和胰島素抵抗，加重糖尿病的發生和發展[13]。研究發現，糖尿病患者腸道菌群失調主要表現為擬桿菌門與大腸桿菌等致病桿菌含量升高，雙歧桿菌含量減少；高脂血癥大鼠腸道菌群失調主要表現為乳酸桿菌及雙歧桿菌的含量減少，而腸桿菌的含量相對增多；其中腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌等可分解蛋白質，產生抑制血管緊張素轉換酶活性的多肽，進而降低血壓[14]。

此外，腸道菌群介導的免疫炎性反應在MS發生發展中起著重要作用[15-18]。就機體免疫系統而言，T淋巴細胞亞群所包含的調節性T細胞（regulatory T cells, Treg）與輔助性T細胞17（helper T cells 17, Th17）分別通過分泌相關免疫因子參與機體炎性免疫應答、抑制免疫炎性反應、維持機體免疫穩態。IL-10是Treg分泌的重要抗炎因子之一，通過抑制主動免疫，減輕機體炎性損傷；而IL-6是Th17分泌的一種重要炎性因子，參與機體免疫炎性損傷的進程。本研究發現治療組IL-10上升幅度及IL-6下降幅度均大于對照組，表明參連對MS患者起到了積極的免疫因子調控作用，進一步證實腸道菌群等代謝產物與Treg/Th17介導的外周免疫平衡的確切關聯[19-21]。

本研究雖然樣本量較小，觀察時間短，但是發現參連聯合常規西藥治療MS患者可提高外周血免疫炎性因子IL-10水平，降低IL-6水平，明顯升高腸道乳酸桿菌含量，上述結果對于探索參連聯合常規西醫治療MS患者“腸道菌群-免疫反應”機制研究具有重要意義。