LncRNA PCED1B-AS1調控NLRP3促進巨噬細胞清除結核分枝桿菌的機制研究

謝玉瑾，宋雪云，馬永春

結核病是一種由單一傳染源引起的傳染性疾病，嚴重威脅人類生命健康[1]。結核分枝桿菌屬于革蘭陽性菌，主要侵犯肺臟，引發肺結核病。結核分枝桿菌主要在巨噬細胞內寄生，當人體免疫力較強時，巨噬細胞可以殺滅細胞內寄生的病原菌，而當人體免疫力較弱時，巨噬細胞免疫反應能力降低，病原菌在巨噬細胞內長期存在[2]。長鏈非編碼RNA（long-non-coding RNA, lncRNA）在人體免疫反應、炎癥反應、細胞運動、新陳代謝等過程中發揮作用，是近些年生命科學領域研究中的重點和熱點[3]。研究發現，lncRNA和結核病發生有關，參與巨噬細胞清除結核分枝桿菌過程，可能是疾病治療的分子靶標[4]。lncRNA PCED1BAS1是在結核病患者中表達下調的調節因子，影響巨噬細胞凋亡，可能是結核病進展中的抑制因子[5]，目前尚未明確其在巨噬細胞清除結核分枝桿菌以及分泌炎癥因子中的作用。本研究以巨噬細胞RAW264.7作為研究對象，探討PCED1B-AS1在巨噬細胞清除結核分枝桿菌以及分泌炎癥因子中的作用和可能機制，旨在為分子靶向治療結核病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 巨噬細胞RAW264.7購自南京科佰生物科技有限公司；結核分枝桿菌H37Rv購自美國ATCC；pcDNA-PCED1B-AS1、pcDNA均由云舟生物科技（廣州）有限公司構建；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLR family pyrindomain containing 3, NLRP3） 小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）、siRNA control由漢恒生物科技（上海）有限公司構建；NLRP3抗體購自美國Abcam；引物由南京金斯瑞生物技術有限公司合成。

1.2 細胞感染模型構建 巨噬細胞于含有1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI1640中培養，培養溫度37 ℃，培養箱中含有5%的CO2，細胞密度超過90%以后，進行細胞傳代。感染結核分枝桿菌的巨噬細胞應為處于對數生長期的細胞，把細胞接種到24孔板內，以H37Rv感染巨噬細胞（感染復數為5），繼續培養4 h以后，添加PBS溶液將細胞洗滌，然后添加新鮮的細胞培養液繼續培養。把沒有感染H37Rv的巨噬細胞命名為Control組，將感染H37Rv以后的巨噬細胞設置為Control+H37Rv組。收集Control組、Control+H37Rv組細胞培養48 h，用于1.3中檢測。

1.3 PCED1B-AS1、NLRP3 和 TNF-α、IL-6 mRNA水平檢測 在細胞內添加Trizol試劑，用移液槍反復吹打混合，促進細胞充分裂解，然后按照常規方法提取細胞總RNA。將提取的RNA沉淀溶解在體積為20 μl的RNase-free水中，放在-80 ℃的冰箱中保存備用。吸取1 μl的RNasefree水將紫外分光光度計清洗，然后吸取1 μl的RNA用于檢測A260/A280的比值，比值在1.8～2.0之間表示純度良好。cDNA合成反應如下：在EP管中添加 1 μl的 Oligo（dT）、1 μg 的 RNA、1 μl的Random primer，最后加ddH2O至總體積達到13 μl，在普通PCR儀上設置65 ℃反應13 min，置于冰上，繼續添加 1 μl的 dNTP、5 μl的 5×RT Reaction Buffer、1 μl 的 RNase inhibitor、1 μl 的M-MLV RTase，加入ddH2O至總體積為25 μl，在普通PCR儀上設置37 ℃條件結合60 min，85 ℃條件結合5 s，放在-20 ℃中保存。PCR的引物序列如下。PCED1B-AS1上游：TCAAGCCAATCAGCTGACAC；下游：AAACAAATGCCCTGCTTGAC。NLRP3上 游：CCCTGCATTTTGTTGTTGTTG； 下游：CCTGCTTCTCACATGTCGTC。TNF-α上游：ACGGCATGGATCTCAAAGAC；下游：GTGGGTGAGGAGCACGTAGT。IL-6上 游：ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC；下游：GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTGG。GAPDH（內參）上游：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；下游：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。PCR反應體系為：2 μl的上游引物、2 μl的下游引物、10 μl的 2×All-in-one qPCR mix、2 μl的 cDNA模板、0.4 μl的 50×ROX reference，加入 ddH2O 至總體積為20 μl，在熒光定量PCR儀中，設置預變性條件為95 ℃ 10 min，變性條件為95 ℃ 10 s，退火條件為56 ℃ 20 s，延伸條件為72 ℃ 30 s，一共進行40個循環。根據反應得到的CT值，經2-△△CT方法計算基因表達變化。

1.4 細胞轉染 將巨噬細胞種植到6孔板內準備細胞轉染。轉染步驟如下：①用50 μl不含血清的RPMI1640把4 μg質粒稀釋，混勻，放在室溫中結合5 min；②用50 μl不含血清的RPMI1640把5 μl的轉染試劑Lipofectamine 2000稀釋，混勻，放在室溫中結合5 min；③將步驟①和②中的試劑混合，在室溫條件下孵育20 min；④收集步驟③中的混合物，添加到6孔板內，放在培養箱中繼續培養6 h。更換細胞培養液，繼續培養12 h。將pcDNAPCED1B-AS1、pcDNA轉染巨噬細胞后，用H37Rv感染（感染復數為5），設置為PCED1BAS1+H37Rv組、Vector+H37Rv組，Control+H37Rv組處理方法同1.2。收集Control+H37Rv、PCED1BAS1+H37Rv、Vector+H37Rv組細胞，按照1.3中方法利用qRT-PCR檢測PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達水平，同時用于1.5和1.6中檢測。

1.5 巨噬細胞清除結核分枝桿菌檢測 巨噬細胞感染后繼續培養72 h，收集細胞裂解物，然后將裂解物種植在含有10% OADC的瓊脂板上，培養24 d，計數結核分枝桿菌菌落量。

1.6 Western blot檢測NLRP3蛋白表達 收集巨噬細胞感染48 h以后的Control+H37Rv組、PCED1B-AS1+H37Rv組、Vector+H37Rv組細胞，在細胞中添加PBS溶液將細胞反復洗滌2次，最后加入RIPA裂解溶液，放在冰上充分裂解20 min，以4 ℃，1000×g離心10 min，將上清轉移到新的EP管中，經過BCA方法檢測蛋白濃度以后，在蛋白樣品中添加5×Loading Buffer充分混合，用于SDS-PAGE電泳。將玻璃板清洗干凈并組裝，制備10%的SDS-PAGE凝膠，在加樣孔內按照每個孔40 μg蛋白添加樣品。把電泳電壓設置為80 V，觀察溴酚藍前端部分進入到分離膠以后，將電泳儀的電壓設置為100 V，等到溴酚藍進入到玻璃板的底部以后，關閉電源，將凝膠取出。根據需要將NC膜裁剪，然后浸泡在轉移緩沖液中備用。轉膜的電壓設置在50 V，轉膜裝置放在冰上進行，轉膜持續40 min之后，將電源關閉。將NC膜浸泡在5%脫脂奶粉中，把非特異性的結合位點封閉。然后將NC膜放在抗體孵育袋中，然后添加按照1∶1000稀釋以后的NLRP3抗體孵育液，在4 ℃的環境中結合過夜。最后將NC膜置于1∶2000稀釋以后的二抗孵育液中，在室溫條件下結合2 h。ECL方法顯色以后，分析目的蛋白的表達水平。NLRP3蛋白水平=NLRP3條帶灰度值÷GAPDH灰度值。

1.7 NLRP3 siRNA影響PCED1B-AS1的作用檢測 在巨噬細胞中共轉染NLRP3 siRNA、pcDNAPCED1B-AS1 和 siRNA Control、pcDNA-PCED1BAS1，然后用H37Rv感染（感染復數為5），設置為PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組和PCED1BAS1+si-NC+H37Rv組，按照1.3、1.5、1.6中方法檢測細胞中TNF-α、IL-6 mRNA水平和細胞清除結核桿菌水平、NLRP3蛋白表達水平。

1.8 統計學處理 實驗重復3次，每組設置3個復孔。用SPSS 21.0軟件統計分析實驗數據，符合正態分布的定量數據用±s表示，2組間的比較用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 H37Rv感染對巨噬細胞中PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達影響 與Control組比較，Control+H37Rv組巨噬細胞中PCED1B-AS1水平降低，TNF-α、IL-6 mRNA水平升高（P均＜0.05）。詳見表1。

表 1 Control組 和 Control+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control group and Control+H37Rv group(±s)

表 1 Control組 和 Control+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control group and Control+H37Rv group(±s)

組別 nPCED1B-AS1 TNF-α mRNA IL-6 mRNA Control組 9 1.00±0.15 1.00±0.11 1.00±0.12 Control+H37Rv 組 9 0.45±0.05 3.84±0.22 2.15±0.16 t值 10.436 34.639 17.250 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 pcDNA-PCED1B-AS1對H37Rv感染的巨噬細胞中PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達影響 pcDNA-PCED1B-AS1轉染后，PCED1B-AS1表達水平升高。與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA水平明顯升高，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。詳見表2。上調PCED1B-AS1促進H37Rv感染的巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA 表達。

表2 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表2 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n PCED1B-AS1 TNF-α mRNA IL-6 mRNA Control+H37Rv 組 9 1.00±0.13 1.00±0.12 1.00±0.12 Vector+H37Rv 組 9 1.00±0.09 1.00±0.10 1.00±0.10 PCED1B-AS1+H37Rv組 9 2.54±0.19* 3.11±0.25* 2.85±0.20*F值 349.336 461.092 478.300 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 過表達PCED1B-AS1對巨噬細胞清除結核分枝桿菌的影響 與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中結核分枝桿菌菌落量明顯降低，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。詳見表3。過表達PCED1BAS1促進巨噬細胞清除結核分枝桿菌。

表3 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中結核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 3 Comparison of Mycobacterium tuberculosis colonies in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表3 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中結核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 3 Comparison of Mycobacterium tuberculosis colonies in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n 菌落量(×105)(CFU)Control+H37Rv 組 9 3.26±0.25 Vector+H37Rv 組 9 3.34±0.36 PCED1B-AS1+H37Rv 組 9 2.23±0.14*F值 48.877 P值 0.000

2.4 過表達PCED1B-AS1對H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達影響 與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中NLRP3蛋白水平明顯升高，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。詳見圖1和表4。過表達PCED1B-AS1促進H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達。

圖1 Western blot檢測pcDNA-PCED1B-AS1轉染后經H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達變化Figure 1 Change of NLRP3 protein expression in H37Rvinfected macrophages after pcDNA-PCED1B-AS1 transfection detected by Western blot detection

表4 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表4 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n NLRP3 mRNA NLRP3蛋白Control+H37Rv 組 9 1.00±0.10 0.45±0.04 Vector+H37Rv 組 9 0.97±0.09 0.47±0.06 PCED1B-AS1+H37Rv 組 9 3.23±0.03* 0.95±0.09*F值 2387.700 162.677 P值 0.000 0.000

2.5 siRNA NLRP3對過表達PCED1B-AS1影響巨噬細胞清除結核分枝桿菌以及表達TNF-α、IL-6 mRNA的作用 與PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組比較，PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組巨噬細胞中NLRP3蛋白表達水平降低，NLRP3 mRNA、TNF-α、IL-6 mRNA水平降低，細胞裂解物中結核分枝桿菌菌落量升高（P均＜0.05），見圖2和表5。siRNA NLRP3減弱過表達的PCED1B-AS1巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平，并且siRNA NLRP3可削弱過表達的PCED1B-AS1巨噬細胞清除結核分枝桿菌功能。

圖2 pcDNA-PCED1B-AS1以及NLRP3 siRNA轉染以后經H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達差異Figure 2 Difference of NLRP3 protein expression levels after transfection with pcDNA-PCED1B-AS1 and NLRP3 siRNA in H37Rv-infected macrophages

表5 PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組和PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白水平、TNF-α、IL-6 mRNA水平和結核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 5 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels, TNF-α, IL-6 mRNA levels and Mycobacterium tuberculosis colonies in PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv group and PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv group(±s)

表5 PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組和PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白水平、TNF-α、IL-6 mRNA水平和結核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 5 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels, TNF-α, IL-6 mRNA levels and Mycobacterium tuberculosis colonies in PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv group and PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv group(±s)

組別 n NLRP3 mRNA NLRP3蛋白 TNF-α mRNA IL-6 mRNA 菌落量(×105)(CFU)PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv 組 9 1.00±0.11 0.96±0.11 1.00±0.08 1.00±0.11 2.21±0.20 PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv 組 9 0.31±0.03 0.46±0.05 0.64±0.06 0.52±0.05 2.89±0.14 t值 18.155 12.414 10.800 11.918 8.356 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討 論

結核病是一種十分常見的傳染病，其發生和結核分枝桿菌的感染有關[6]。結核分枝桿菌誘發結核病的過程較為復雜，主要通過寄生在巨噬細胞內達到在體內長期存在的目的[7]。當機體免疫力較強時，巨噬細胞被活化，分泌大量炎癥因子，促進免疫反應，細胞凋亡增加，結核分枝桿菌被清除[8]。而當機體免疫力較低時，巨噬細胞免疫反應水平下降，結核分枝桿菌則長期且大量存在于巨噬細胞內[9]。研究發現，結核分枝桿菌促進巨噬細胞中炎癥因子的表達，這些炎癥因子包括TNF-α、IL-6等[10]。本研究發現，結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平升高，這與上述的研究結果相符合，說明結核分枝桿菌誘導巨噬細胞分泌炎癥因子。

LncRNA長度＞200 nt，在人體內的多種組織如腦、肝、肺、腎中均有表達，并且對不同類型的細胞分化、衰老、氧化應激、炎癥因子分泌等有調節作用[11]。很多研究顯示，lncRNA在人類疾病中發揮作用，如心肌病、關節炎、糖尿病等[12-14]。近些年也有很多實驗發現lncRNA與結核病的進展有關，結核病患者體內有著與健康人差異較大的基因表達譜，而且這些基因多數被證明與結核病的惡性進展有關[15-16]。PCED1B-AS1是近些年發現的調控因子，參與腫瘤進展，能夠促進膠質瘤、膠質母細胞瘤細胞的惡性生物學行為[17-18]。在結核病患者中發現PCED1B-AS1異常低表達，敲除PCED1B-AS1可降低巨噬細胞凋亡水平，增加細胞自噬，而上調PCED1B-AS1則有相反的作用，PCED1B-AS1可能通過促進細胞凋亡發揮抗肺結核的作用[5]。本研究發現結核分枝桿菌感染以后的巨噬細胞中PCED1B-AS1表達水平下降，并且上調PCED1B-AS1可加強巨噬細胞對結核分枝桿菌的清除作用，提高巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平，這證明PCED1B-AS1可能通過促進巨噬細胞免疫反應和清除結核分枝桿菌發揮抗結核作用。

進一步研究PCED1B-AS1的可能機制，發現上調PCED1B-AS1可促進巨噬細胞中NLRP3蛋白表達。NLRP3是NLR蛋白家族成員，被激活后可促進NLRP3炎癥小體作用發揮[19-21]。NLRP3在慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、支氣管哮喘等過程中發揮作用[22-24]。在肺結核的研究中證實，結核分枝桿菌能夠激活NLRP3，誘導巨噬細胞抗結核的免疫反應[25-27]。本研究發現，下調NLRP3可以逆轉PCED1B-AS1對巨噬細胞分泌炎癥因子和清除結核分枝桿菌的作用，提示PCED1B-AS1可能通過NLRP3參與巨噬細胞抗結核過程。

綜上所述，上調PCED1B-AS1可促進巨噬細胞對結核分枝桿菌的清除，并且可以誘導巨噬細胞分泌炎癥因子，機制可能與下調NLRP3有關，目前對PCED1B-AS1通過何種靶向機制最終影響NLRP3參與巨噬細胞抗結核分枝桿菌的調控機制尚不明確，將在后續的實驗中進行探討。本次實驗為研究PCED1B-AS1在結核病發生中的作用和機制提供了參考，為靶向分子治療結核病提供了可能思路。