AIDS合并播散性馬爾尼菲籃狀菌感染患者的白細胞散點圖及血細胞形態特點

羅曉成，曹存巍，麻秋英，磨立達，羅曉璐

馬爾尼菲籃狀菌（Talaromycemarneffei, TM）是一種溫度依賴的雙相型真菌，在體內呈酵母相，易導致血流播散性感染從而引起馬爾尼菲籃狀菌病（talaromycosis marneffei, TSM）。該病在東南亞及我國南方地區的廣西、廣東兩省呈區域性流行，多見于免疫力低下的人群，尤其是AIDS患者。據統計，廣西有16%的AIDS患者合并TSM，且合并TSM的病死率是所有AIDS并發癥中最高的[1]，AIDS合并TSM患者的臨床表現無特異性，約38.1%的患者被誤診為肺結核并接受了抗結核治療[2]，因此早期正確診斷具有重要意義。臨床工作中發現，根據白細胞散點圖信息提示，結合血涂片鏡檢，有助于本病的早期診斷。因此，本研究收集了AIDS合并TSM患者、單純HIV感染者和AIDS合并其他并發癥患者，分析3類患者的白細胞散點圖、白細胞手工分類計數、外周血涂片特點及其他實驗室檢查指標，尋找早期診斷播散性TM感染的特征，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019年3月—2020年6月南寧市第四人民醫院通過外周血涂片診斷的27例AIDS合并TSM患者作為AIDS合并TSM組；另隨機選取同時期我院收治的80例單純HIV感染者（單純HIV感染組）及27例AIDS合并其他并發癥（細菌性肺炎、肺結核、口腔真菌感染）患者（AIDS合并其他并發癥組）分別作為對照。所有患者均經過廣西壯族自治區疾病預防控制中心或我院HIV確證實驗室確證為HIV感染。3組的年齡、性別、婚姻狀況、感染途徑比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05），在是否規律抗病毒治療及治療結局方面相比，3組差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。該研究通過南寧市第四人民醫院倫理委員會審核并獲得參與者的知情同意。

表1 研究對象的一般資料[例（%）]Table 1 Baseline date of included patients[cases(%)]

1.2 方法

1.2.1 使用邁瑞BC-6900全自動血細胞分析儀進行血常規檢測，得到白細胞散點圖信息及白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板等參數。

1.2.2 血涂片制備和染色 參照全國臨床檢驗操作規程并結合本實驗室操作手冊進行。血涂片要厚薄均勻，頭體尾分明。鏡檢時先用低倍鏡瀏覽全片，觀察細胞分布和染色情況，估計白細胞、血小板數量是否與儀器檢驗相符，然后選擇體尾交界處，用油鏡鑒定細胞并進行分類，尤其注意涂片尾端、兩側有無巨大及異常細胞。有核紅細胞數量通過鏡檢分類100個白細胞時計數所得。并按公式：校正前白細胞數/L×[100/（100+有核紅細胞數）]=校正后的白細胞數/L，對白細胞總數進行校正。

1.2.3 白細胞散點圖分析原理 邁瑞BC-6900全自動血液分析儀，使用激光散射結合熒光染色多維分析技術，根據前向散射光（FSC：細胞體積）、側向散射光（SSC：細胞內部復雜程度）、側向熒光（SFL：細胞核酸含量）3種信號在三維立體空間中的分布，產生各種散點圖來區分白細胞各群，同時可檢出有核紅細胞、異常細胞或幼稚細胞等。正常各細胞成分在散點圖的分布如圖1A所示，各細胞團粒子間分界清楚。

1.2.4 實驗室檢測 AST、ALT使用日立全自動生化分析儀檢測；1，3-β-D真菌葡聚糖（BDG）檢測使用廣東省湛江安度斯生物有限公司生產的試劑及LKM動態試管檢測儀檢測。CD4+T淋巴細胞計數采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀檢測。

1.2.5 血培養鑒定 無菌采集外周血進行血培養，血培養瓶報陽后及時轉種血培養基和2個沙保羅培養基，分別于25 ℃、35 ℃培養。根據25 ℃培養2～3 d就產生絨狀的菌絲相菌落，有特征性的紅色色素溶解于培養基中，并經棉蘭染色鏡檢，觀察到特異帚狀枝等特性鑒定是否為TM。

1.3 統計學處理 本研究所有數據采用Excel 2007、SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料以例數和百分數表示，組間比較用四格表χ2檢驗或者R×Cχ2檢驗；非正態分布的計量資料數據使用中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 散點圖結果 單純HIV感染組（n=80）的散點圖均表現為圖1A（80例）；AIDS合并TSM組（n=27）的白細胞散點圖表現有圖1B（16例）、圖1C（5例）、圖1D（6例），分別表現為在有核紅細胞區域出現散點，有核紅細胞區域散點合并幼稚粒細胞散點，出現有核紅細胞及細胞亞群不能區分的散點；AIDS合并其他并發癥組（n=27）的散點圖表現有圖1A（18例）、圖1E（9例），圖1E表現為粒細胞散點稍上移。

圖1 3組白細胞散點圖A.正常散點圖；B.出現有核紅細胞的散點圖；C.出現有核紅細胞及幼稚粒細胞的散點圖；D.出現有核紅細胞及細胞亞群不能分類的散點圖；E.粒細胞散點稍上移的散點圖Figure 1 White blood cell scatter diagrams in 3 groups

2.2 外周血有核細胞檢測結果 AIDS合并TSM組的白細胞分類以中性粒細胞增多為主，且均出現不同程度的核左移；AIDS合并TSM組在分類時可見有核紅細胞8個/100個白細胞～510個/100個白細胞不等，該組有核紅細胞水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組白細胞分類結果及有核紅細胞比較[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of white blood cell classification and nucleated red blood cells in 3 groups[M(P25, P75)]

2.3 血涂片結果 AIDS合并TSM組的27例患者均在外周血涂片中見到粒細胞吞噬1～20個菌體（見圖2），偶見單核細胞吞噬。菌體多數見于細胞內，少部分病例的細胞外也可見大量散在的菌體。該菌體大小不均，呈類圓形、臘腸形、長圓形等，部分具有橫膈，胞壁著色欠清晰，胞漿染淡藍色，有1～2個紫紅色小核。部分吞噬了菌體的噬菌細胞體積較大，或在菌體周圍形成較大類圓形空泡，易在低倍鏡下被發現。血涂片均可見不同程度核左移（出現中、晚幼粒細胞）、粒細胞有中毒顆粒、粒細胞核形畸形等，易見到有核紅細胞。單純HIV感染組的外周血涂片形態未見明顯異常。AIDS合并其他并發癥組的外周血細胞形態以核左移、粒細胞假性Pelger-Huet核多見，少數有核形畸形表現，未見有核紅細胞。

圖2 播散性TSM患者的外周血涂片結果A.散落在細胞外的TM菌體，有的菌體可見中間的橫膈；B～C.中性粒細胞吞噬TM菌體和細胞內大的空泡；D.有核紅細胞，中性粒細胞吞噬多個TM菌體Figure 2 Peripheral blood smears findings of patients with disseminated TSM

2.4 其他實驗室檢查結果 3組白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、AST、ALT、BDG以及CD4+T淋巴細胞水平比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 3組實驗室結果比較[M(P25, P75)]Table 3 Comparison of laboratory test results in 3 groups[M(P25, P75)]

2.5 血培養的結果 AIDS合并TSM組27例患者的血培養均培養出TM。血培養鑒定后報告陽性的時間最短為4 d，最長5 d。

3 討 論

AIDS合并TSM病情兇險，病死率高[3]。有研究表明，AIDS合并TSM患者早期死亡的兩個獨立預測因子是診斷不及時和抗真菌治療不及時[4]。目前TSM的病原學診斷主要是真菌培養[5]，但真菌培養耗時長，無法滿足臨床快速診斷的需求。PCR技術、酶聯免疫吸附實驗、基因芯片、血清Mp1p抗原檢測、高通量測序等，在一定程度上提高了TSM診斷的敏感性和特異性[6-9]，但由于操作步驟繁瑣，對人員資質要求較高及受設備技術要求等限制，尚未在臨床中廣泛應用。有文獻報道，在發生TM血液播散性感染的患者中，可利用血涂片鏡檢，實現TM感染的快速診斷[10-11]。而如何發現異常的血涂片，提示檢驗醫師進行進一步的檢查則未見報道。

本團隊在工作中觀察到AIDS合并TSM組的白細胞散點圖均出現異常，進而開展了相關研究。結果顯示，AIDS合并TSM組的白細胞散點圖均在有核紅細胞區域出現異常散點、出現幼稚粒細胞或細胞亞群不能區分等現象。有核紅細胞與淋巴細胞大小相似，但核酸含量低，內部結構復雜程度也低，因而散點出現在正常淋巴細胞下方區域，呈深藍色，易于識別。未成熟粒細胞因其體積較大，核質比高，核酸含量高于成熟粒細胞，熒光染色強，因此在正常粒細胞區域的上方出現。當細胞形態與結構發生較大變化時，儀器不能正確識別，因而出現粒子團間分界不清、細胞不分類的情況。已明確HIV感染對骨髓造血功能會產生嚴重干擾，粒、紅、巨三系均可發生病態造血[12]。故AIDS合并TSM組與AIDS合并其他并發癥組均可見到多種核形異常的粒細胞及幼稚粒細胞。但AIDS合并其他并發癥組不伴有核紅細胞出現。涂片鏡檢時，注意用低倍鏡尋找有無體積較大的、有空泡的粒細胞，發現可疑情況時轉用油鏡仔細觀察。觀察到細胞內被吞噬的菌體，對于排除污染有意義；觀察到菌體中部的橫膈是TM裂殖的特征，也是TM與杜氏利什曼小體、組織胞漿菌等鑒別的重要特征。

有核紅細胞在骨髓中屬于正常細胞，但在外周血中屬于不成熟細胞，即為病理狀態，常見于溶血性貧血、急性大量失血、血液系統惡性腫瘤、骨髓轉移性腫瘤、骨髓纖維化、嚴重組織缺氧等多種疾病。產生的機制多與髓血屏障破壞、釋放加速及髓外造血和脾切除術、缺氧有關[13-14]。在膿毒血癥、重癥監護等患者群體中，有核紅細胞在血液中的存在明顯增加了死亡風險，日常有核紅細胞監測可以作為評價危重患者存活、出院結局預后、膿毒癥嚴重程度和死亡風險的指標。在本研究中，出現了有核紅細胞的AIDS合并TSM組死亡患者比例明顯高于另外2組，差異有統計學意義。有文獻報道，TM感染發熱患者中，有部分患者出現呼吸困難且均為Ⅰ型呼吸衰竭伴低氧血癥[2]。有核紅細胞在AIDS合并TSM患者外周血中大量出現，推測與嚴重感染、低氧血癥有關。

研究發現播散性TSM好發于CD4+T淋巴細胞計數＜50個/μl的AIDS患者[16]，與本研究結果相似。同時本研究結果顯示：AIDS合并TSM組的血小板、CD4+T淋巴細胞水平明顯降低，中性粒細胞比例、AST及BDG水平明顯升高，提示中性粒細胞比例、CD4+T淋巴細胞、血小板、AST、BDG可作為AIDS合并TSM的觀察指標。

綜上所述，AIDS患者血常規出現血小板水平明顯降低、中性粒細胞水平明顯增高，散點圖出現有核紅細胞提示時，應盡早涂片鏡檢尋找有無TM。此方法簡單快速、損傷小，易操作，易推廣。