肝細(xì)胞癌人源異種移植模型應(yīng)用研究進(jìn)展

李曉娟，馮 帆，李瑞生，貌盼勇

肝細(xì)胞癌是我國(guó)乃至全世界最常見(jiàn)的高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居我國(guó)惡性腫瘤第三位，病死率高居第二位[1-3]。另外，我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)國(guó)家，因此造成肝細(xì)胞癌發(fā)病率居高不下[4-5]。肝細(xì)胞癌的早期診斷普及程度低，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期[6]，失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)，即使進(jìn)行了手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高[7]。因此，建立能夠模擬臨床特征的肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型，對(duì)于肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制、早期診斷、早期干預(yù)治療及新型治療方法評(píng)估等方面的研究具有重要的意義[8]。

目前研究肝細(xì)胞癌常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型包括細(xì)胞系腫瘤（cell line-derived xenografts, CDX）模型、人源異種移植（patient-derived xenograft,PDX）模型和遺傳工程小鼠模型（geneticallyengineered mouse models, GEMM）等。PDX模型是將取自臨床患者的新鮮腫瘤組織直接異種移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的動(dòng)物模型[9]。相較于其他類型動(dòng)物模型，PDX模型更大程度地保留了人類原發(fā)腫瘤的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）以及細(xì)胞外基質(zhì)，能夠更好地反映腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞及周圍基質(zhì)之間的密切聯(lián)系和相互作用，在模擬人體腫瘤組織的血管生成、發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[10-11]。同時(shí)PDX模型不僅能夠保留原代腫瘤的遺傳學(xué)特征（如原始癌癥的表型和分子特征），也可作為篩選抗癌藥物、評(píng)價(jià)藥物的臨床療效及不良反應(yīng)很好的工具[12]，還能準(zhǔn)確反映人類腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[13]，在藥物有效性研究、臨床預(yù)后預(yù)測(cè)等方面優(yōu)勢(shì)明顯[14]。PDX模型還能夠保留不同患者原代腫瘤的特性并對(duì)原代腫瘤進(jìn)行傳代，可作為腫瘤個(gè)性化治療的研究標(biāo)本[15]。因此，肝細(xì)胞癌PDX模型在藥物和生物標(biāo)志物篩選及聯(lián)合臨床試驗(yàn)中顯示出作為臨床前模型的優(yōu)勢(shì)。

PDX模型構(gòu)建的成功率與很多因素有關(guān)，如腫瘤的類型和惡性程度、受體動(dòng)物類型、移植方法和部位等[12]。本文對(duì)肝細(xì)胞癌PDX模型構(gòu)建中所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的類型、移植部位和方法、移植手術(shù)的影響因素以及PDX模型在肝細(xì)胞癌研究應(yīng)用中的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 肝細(xì)胞癌PDX模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

PDX模型是不同物種之間的移植類型，必須選用具有免疫缺陷的小鼠。

1.1 裸小鼠 裸小鼠的主要特征是缺乏成熟的T淋巴細(xì)胞，而B(niǎo)淋巴細(xì)胞正常，但功能不完善。最常用的品系為BALB/c裸小鼠。裸小鼠幼年時(shí)NK細(xì)胞活性低下，成年后NK細(xì)胞會(huì)恢復(fù)至略高于正常小鼠，同時(shí)T淋巴細(xì)胞也會(huì)增加，這些恢復(fù)的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及抗原提呈細(xì)胞等使裸小鼠的移植排斥作用也隨之增加[16]。因此一般選用4～6周齡裸小鼠。在移植腫瘤實(shí)驗(yàn)操作中，無(wú)須對(duì)裸小鼠進(jìn)行前處理，成功率較高，移植傳代后的腫瘤組織能夠很好地保留其原有的特性。

1.2 重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）小鼠 SCID小鼠被毛正常，T、B淋巴細(xì)胞均缺失，異種移植腫瘤組織的成功率明顯高于裸小鼠。在SCID小鼠體內(nèi)能夠觀察到較高的腫瘤轉(zhuǎn)移率，因此可作為研究腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和免疫治療的良好模型[17]。SCID小鼠的T、B淋巴細(xì)胞的免疫功能也會(huì)隨著周齡的增加部分恢復(fù)[18]。研究者為保證移植成功率，首次移植可以先選擇SCID小鼠，而在后續(xù)移植傳代中為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間和節(jié)省研究經(jīng)費(fèi)選用裸小鼠[19]。

1.3 NOD/SCID小鼠 NOD/SCID小鼠是由NOD/Lt小鼠（胰島素依賴性糖尿病小鼠）和SCID小鼠雜交獲得，該小鼠T、B淋巴細(xì)胞缺陷，NK細(xì)胞活性很低，巨噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的功能也受到損害。由于其免疫缺陷程度高，不易發(fā)生免疫逃逸，因此其異種移植成功率顯著高于SCID小鼠，是目前公認(rèn)異種移植腫瘤動(dòng)物模型理想的選擇之一。但該小鼠的壽命較短，不建議進(jìn)行實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)的研究。

1.4 NOG小鼠 NOG小鼠是由NOD/SCID小鼠與IL-2γnullKO小鼠雜交而獲得，缺乏T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能減退，補(bǔ)體活性缺乏，其免疫功能嚴(yán)重不全，因此異種移植成功率顯著高于NOD/SCID小鼠，也是公認(rèn)的異種移植模型理想的選擇之一，廣泛應(yīng)用于免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和腫瘤方面的研究領(lǐng)域[20]。

1.5 B-NSG小鼠 B-NSG小鼠是利用基因編輯技術(shù)將NOD小鼠Prkdc和IL2rg雙基因敲除而獲得。該小鼠沒(méi)有成熟T、B淋巴細(xì)胞和功能性NK細(xì)胞，細(xì)胞因子信號(hào)傳遞能力缺失，對(duì)人源組織幾乎不存在排斥反應(yīng)，免疫缺陷程度最高。同時(shí)其平均壽命長(zhǎng)達(dá)1.5年，是進(jìn)行人源細(xì)胞或組織移植最理想的模型小鼠。

總之，免疫缺陷小鼠種類較多，研究者可根據(jù)課題的需求及經(jīng)費(fèi)等方面綜合考慮，選擇不同免疫缺陷小鼠用以發(fā)揮最佳作用，為肝細(xì)胞癌的研究提供合適的PDX模型（見(jiàn)表1）。

表1 PDX模型常用免疫缺陷小鼠總結(jié)Table 1 Summary of immunodeficient mice commonly used in PDX model

2 肝細(xì)胞癌PDX模型移植部位和方法的選擇

2.1 皮下移植 皮下移植實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，便于觀察，是最常采用的方法。移植部位多選擇頭部皮下、腋下或雙側(cè)腹股溝。這些部位操作簡(jiǎn)單，腫瘤易成活，且易于觀察腫瘤，腫瘤的生長(zhǎng)也不會(huì)影響小鼠的正常活動(dòng)。該方法常應(yīng)用于肝細(xì)胞癌新藥物篩選實(shí)驗(yàn)、藥物療效對(duì)比實(shí)驗(yàn)等研究[21-22]。但由于小鼠皮下缺乏腫瘤相關(guān)的微環(huán)境，很少會(huì)出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，因此這種方式不適用于構(gòu)建分化程度高、惡性程度低的腫瘤移植模型[23]。

2.2 肝臟原位移植 肝臟原位移植的方式分為原位注射懸液與原位微組織塊移植兩種。原位注射懸液操作簡(jiǎn)單，部分研究者采用了此法[24]。原位微組織塊移植是將腫瘤組織切成微組織塊移植到與原發(fā)部位相同的動(dòng)物臟器，也稱為患者源性原位異種移植（patient-derived orthotopic xenograft,PDOX）。微組織塊能夠很好地保留人源肝臟腫瘤的微環(huán)境，而腫瘤周邊的小鼠肝臟供給腫瘤生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，不但能夠更好地模擬肝臟腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，還能夠保留患者肝臟腫瘤組織的異質(zhì)性。相比于皮下移植方式，PDOX模型能夠更準(zhǔn)確地模擬腫瘤在人體內(nèi)的進(jìn)展全過(guò)程，同時(shí)更易出現(xiàn)與臨床相似的腫瘤轉(zhuǎn)移特征[25]。但原位移植手術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，成瘤率較低，而且不能直接觀察，須剖腹才能順利觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，是其發(fā)展推廣的瓶頸。因此，研究者借助多項(xiàng)影像學(xué)技術(shù)手段，同時(shí)依托PDX模型來(lái)評(píng)價(jià)新型影像學(xué)技術(shù)在肝細(xì)胞癌早期的預(yù)防與診斷，對(duì)肝細(xì)胞癌的后續(xù)治療與預(yù)后可提供寶貴的指導(dǎo)意見(jiàn)。Yang等[26]利用PET技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞移植模型和PDX模型進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，評(píng)價(jià)PET對(duì)早期肝細(xì)胞癌的檢測(cè)能力和預(yù)測(cè)能力。Zhang等[27]利用NIRF/PET雙模成像探針對(duì)小鼠PDX、CDX模型及家兔肝細(xì)胞癌模型進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析，以期成為肝細(xì)胞癌早期預(yù)測(cè)和檢測(cè)的有力手段。

2.3 人源化異種移植模型 目前多數(shù)構(gòu)建的PDX模型都有一個(gè)相同的缺陷，那就是缺乏人類的免疫大環(huán)境，因此研究者開(kāi)發(fā)出人源化異種移植模型。在造模過(guò)程中，不僅移植人源腫瘤組織，還將其他人源組織和細(xì)胞導(dǎo)入或?qū)⑷祟惸承┨囟ɑ蚯萌朊庖呷毕輨?dòng)物體內(nèi)，使移植的腫瘤能夠更好地在與人類非常相似的免疫大環(huán)境中模擬生長(zhǎng)[25，28]。Zhao等[29]在傳統(tǒng)PDX模型的基礎(chǔ)上，成功建立了肝細(xì)胞癌PDX人源化模型，即具備人類免疫系統(tǒng)的PDX模型，能夠?qū)Ω渭?xì)胞癌的免疫治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。而Jiang等[30]利用 NOD/SCID/IL2rg?/?小鼠建立 PDX 模型，評(píng)價(jià)Glypican 3-CAR T細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞癌PDX模型的有效性以及對(duì)臨床的指導(dǎo)意義。此類人源化異種移植模型的優(yōu)勢(shì)在于模擬了更加相似的人體腫瘤微環(huán)境和大環(huán)境，使腫瘤生物學(xué)行為充分表達(dá)，還可減少腫瘤傳代過(guò)程中出現(xiàn)的組織差異，因此在腫瘤免疫學(xué)研究方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[31]。但該模型對(duì)技術(shù)要求較高，操作有一定難度，難以得到廣泛應(yīng)用。

綜上所述，影響PDX模型構(gòu)建的因素主要包括：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇。綜合各項(xiàng)因素首選NOD/SCID小鼠和NOG小鼠。②腫瘤組織特性。腫瘤標(biāo)本的病理類型、分化程度和惡性程度等對(duì)構(gòu)建的模型影響也較大[32]。臨床預(yù)后不良的患者，其腫瘤的分化程度低，惡性程度高，異種移植的成瘤率高，相反則低。③手術(shù)操作的影響。新鮮腫瘤標(biāo)本從患者體內(nèi)取出后，應(yīng)以最快速度保存于4 ℃培養(yǎng)基中[33]，隨后異體移植盡量在離體1 h內(nèi)完成；手術(shù)操作的熟練程度及手術(shù)全程的無(wú)菌意識(shí)均影響成瘤率。

3 PDX模型在肝細(xì)胞癌研究中的應(yīng)用

3.1 肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制研究 PDX模型多用于肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制等研究。Zhao等[34]對(duì)肝細(xì)胞癌患者和相關(guān)PDX模型中CD133、CD90、CD44等因子的表達(dá)進(jìn)行了定量檢測(cè)，并與腫瘤患者和PDX模型的腫瘤和癌旁組織的免疫組化結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。Matsuki等[35]應(yīng)用2個(gè)PDX模型證實(shí)了新型分子靶向藥物侖伐替尼具有通過(guò)抑制FGF信號(hào)通路活性抑制肝細(xì)胞癌腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲等作用。Cheung等[36]分別用進(jìn)展期和非進(jìn)展期肝細(xì)胞癌組織構(gòu)建肝癌細(xì)胞系并建立PDX模型，為肝細(xì)胞癌的研究提供模型平臺(tái)。Yang等[37]利用PDX模型進(jìn)行全基因組測(cè)序，評(píng)價(jià)了以JAK1基因?yàn)榇淼男盘?hào)通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。Ding等[38]利用PDX模型分析了β-catenin在基因和蛋白水平上的激活狀態(tài)。

3.2 臨床前抗腫瘤藥物療效評(píng)估 PDX模型廣泛用于肝細(xì)胞癌的臨床前抗腫瘤藥物療效方面的研究，能夠?qū)Ω渭?xì)胞癌的臨床治療提供指導(dǎo)，同時(shí)對(duì)于新藥的研發(fā)和應(yīng)用具有很重要的意義。

3.2.1 PDX模型在肝細(xì)胞癌信號(hào)通路研究中的應(yīng)用 目前，索拉非尼是抗肝細(xì)胞癌的一線藥物，以索拉非尼為代表的分子靶向藥物在進(jìn)展期肝細(xì)胞癌治療中發(fā)揮了重要作用，其抗癌機(jī)制是通過(guò)抑制多種絲氨酸/蘇氨酸和受體酪氨酸激酶，從而抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用[39]。雖然索拉非尼能夠顯著延長(zhǎng)部分肝細(xì)胞癌患者的生存期，但還存在未能抑制的信號(hào)通路，如磷化硫醇3-激酶/蛋白激酶b信號(hào)通路[40]，這些信號(hào)通路反過(guò)來(lái)能夠促進(jìn)索拉非尼耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，從而出現(xiàn)更加難以克服的耐藥現(xiàn)象。研究者利用PDX模型對(duì)索拉非尼的抗癌機(jī)制以及在抗癌過(guò)程中可能會(huì)影響其作用的生物標(biāo)志和信號(hào)通路進(jìn)行了深入的研究，同時(shí)也對(duì)開(kāi)發(fā)其他抗肝細(xì)胞癌的藥物和成分展開(kāi)了研究。Wu等[41]通過(guò)建立PDX模型證明了利用CDK1抑制劑阻斷CDK1/PDK1/β-Catenin信號(hào)通路能夠增強(qiáng)索拉非尼抗腫瘤應(yīng)答。Wang等[42]利用PDX模型研究發(fā)現(xiàn)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）的活性能夠顯著增強(qiáng)索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的作用。Liang等[43]應(yīng)用PDX模型驗(yàn)證pERK是評(píng)價(jià)索拉非尼治療肝細(xì)胞癌時(shí)一項(xiàng)顯著的生物標(biāo)志物。當(dāng)索拉非尼通過(guò)RAF/MEK/ERK通路發(fā)揮作用時(shí)，pERK會(huì)出現(xiàn)顯著下調(diào)。Tao等[44]通過(guò)構(gòu)建肝細(xì)胞癌PDX模型研究索拉非尼耐藥組與敏感組中DKK1的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低DKK1表達(dá)可增強(qiáng)索拉非尼的敏感性。

3.2.2 PDX模型在肝細(xì)胞癌藥物敏感性方面的研究應(yīng)用 PDX模型因保留患者腫瘤的分子特性和異質(zhì)性，能夠再現(xiàn)患者的藥物敏感性特征，被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞癌臨床前藥物敏感性研究。Kissel等[21]以瑞戈非尼和索拉非尼為模型藥物，比較了H129小鼠肝癌模型和PDX模型對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性差異。Lv等[22]利用肝癌細(xì)胞系和PDX模型評(píng)價(jià)了Vc通過(guò)SVCT-2對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，PDX模型對(duì)抗癌藥物的反應(yīng)與提供腫瘤樣本的實(shí)際患者反應(yīng)相似[47]。因此，PDX模型有助于測(cè)試某些藥物的治療反應(yīng)，并且可以從異種移植組織獲得治療后數(shù)據(jù)[48]。表2總結(jié)了肝細(xì)胞癌PDX模型相關(guān)研究的文獻(xiàn)資料。另外，我們還注意到，在其他類型腫瘤如肺癌、腸癌等研究中，應(yīng)用上海立迪生物技術(shù)股份有限公司新型開(kāi)發(fā)的OncoVee?MiniPDX （MiniPDX） 模型進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)臨床用藥起到指導(dǎo)性作用[49-50]。MiniPDX模型將患者或PDX來(lái)源的腫瘤細(xì)胞注入改良的微膠囊和中空纖維培養(yǎng)體系后置入小鼠皮下，其整合了中空纖維和PDX模型的優(yōu)點(diǎn)，將體外分離腫瘤原代細(xì)胞與體內(nèi)藥物敏感測(cè)試結(jié)合起來(lái)，可在7 d內(nèi)獲得臨床針對(duì)該患者治療藥物敏感性的試驗(yàn)結(jié)果，因此該模型能夠滿足腫瘤晚期或進(jìn)展期患者治療藥物選擇的迫切需求[51]。但是目前肝癌的MiniPDX模型報(bào)道還很少見(jiàn)，可以作為未來(lái)研討和深入研究的方向。

表2 肝細(xì)胞癌PDX模型相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)Table 2 Summary of literature on hepatocellular carcinoma PDX models

4 PDX模型相關(guān)研究存在的問(wèn)題

PDX模型是肝細(xì)胞癌基礎(chǔ)研究的重要手段之一，目前肝細(xì)胞癌PDX模型研究已取得一些進(jìn)展，但仍存在諸多局限性和挑戰(zhàn)：①與肺癌、胃癌以及乳腺癌等相比，肝細(xì)胞癌相關(guān)PDX研究報(bào)道數(shù)量相對(duì)較少，研究不夠深入。②在臨床腫瘤體積很大的情況下，需要病理學(xué)家和外科醫(yī)生的協(xié)助選取更合適的腫瘤組織作為后續(xù)研究的標(biāo)本。③現(xiàn)有的PDX模型多數(shù)是利用肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本建立原代細(xì)胞系后移植于裸鼠皮下，難以反映腫瘤細(xì)胞在肝臟原位的生長(zhǎng)情況。④PDX模型的建模周期較長(zhǎng)，通常需要2～8個(gè)月。⑤部分患者腫瘤的移植成瘤率比較低。⑥免疫缺陷小鼠傳代至3～5代時(shí)，原代腫瘤的基質(zhì)成分會(huì)被小鼠基質(zhì)所代替。盡管與現(xiàn)有細(xì)胞系相比，原代細(xì)胞系更加接近和反映患者的個(gè)體特性，但在制備PDX的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞遺傳背景是否能夠保持穩(wěn)定，目前尚無(wú)高效、準(zhǔn)確以及公認(rèn)的檢測(cè)方法。⑦現(xiàn)有肝臟腫瘤標(biāo)本的保存策略主要是保存蠟塊和冷凍標(biāo)本，或凍存原代細(xì)胞系，對(duì)組織的保存與利用不足。⑧目前應(yīng)用PDX模型進(jìn)行肝細(xì)胞癌相關(guān)藥物敏感檢測(cè)的報(bào)道仍舊極少。⑨研究成本相對(duì)較高，由于免疫缺陷小鼠價(jià)格昂貴，腫瘤的形成需要很長(zhǎng)的時(shí)間，因此開(kāi)發(fā)PDX模型需要很高的成本。

正因?yàn)楦渭?xì)胞癌PDX模型有上述諸多困難需要克服，其應(yīng)用并不如其他類型腫瘤PDX模型更加廣泛。但由于其具有獨(dú)特性和諸多優(yōu)勢(shì)，肝細(xì)胞癌PDX模型仍然被認(rèn)為是一種有價(jià)值的臨床前研究工具。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，盡管肝細(xì)胞癌PDX模型存在一些局限性，但該模型在藥物篩選、生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)和聯(lián)合臨床試驗(yàn)等臨床前試驗(yàn)中具有的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)越來(lái)越顯著。肝細(xì)胞癌PDX模型還有利于腫瘤患者個(gè)性化藥物的篩選，能夠更好地實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療。利用PDX模型為肝細(xì)胞癌患者選擇更有效的藥物，既能節(jié)省治療費(fèi)用，又盡可能提高了患者生存率和生活質(zhì)量。尤其在出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后，還有助于臨床二、三線藥物的選擇[60]。對(duì)于肝細(xì)胞癌PDX模型缺乏人源化免疫系統(tǒng)的短板，研究者不斷探索將人的造血干細(xì)胞移植于X線照射的重度免疫缺陷小鼠，再將患者的腫瘤組織移植于該小鼠形成人源化腫瘤模型[61-62]。此類模型可以很好地模擬人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，多用于研究肝臟腫瘤靶向治療，尤其適用于腫瘤免疫治療方面的研究[63]。目前，研究者應(yīng)用肝細(xì)胞癌PDX模型不斷深入地探索肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的原因，可協(xié)助對(duì)肝細(xì)胞癌臨床治療提出多樣化和個(gè)性化的方案，期待肝細(xì)胞癌PDX模型在未來(lái)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療方面能夠發(fā)揮更強(qiáng)的作用。