lncRNA PWRN2在膠質瘤組織中的表達及對膠質瘤細胞增殖和遷移能力的影響

馬迎輝 胡勝 胡驍 吳勇 金杰

鄂東醫院集團黃石市中心醫院湖北理工學院附屬醫院神經外科 435000

膠質瘤是成年人最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，手術切除、放療和化療是膠質瘤主要的治療方法，但其整體預后較差［1］。膠質瘤細胞增殖和轉移是影響其療效和預后的主要因素，探究膠質瘤發生、發展的分子機制有助于尋找新的治療靶點和提供膠質瘤的診治水平［2］。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一類非編碼RNA，長度超過200個核苷酸，在細胞的生理和病理過程中發揮重要作用［3］。越來越多的研究證實，lncRNA參與調控腫瘤細胞的生長和轉移過程，與腫瘤患者的生存期密切相關［4］。lncRNA已成為近年來膠質瘤研究的熱點。PWRN2屬于lncRNA家族成員，其在膠質瘤中的表達及生物學功能并不清楚。本研究通過檢測膠質瘤組織和細胞株中PWRN2的表達，觀察PWRN2對膠質瘤細胞增殖和遷移過程的調控作用，探究PWRN2可能的作用機制，為膠質瘤的分子診斷和基因靶向治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床標本、細胞系和主要試劑 選取2018年1月至2019年12月本院神經外科行手術切除并經病理證實為膠質瘤的腫瘤組織和對應癌旁組織，組織標本于液氮中保存。所有膠質瘤患者術前均未行化療或放療。HEB、U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；陰性對照病毒（LV-NC）、PWRN2重組慢病毒（LV-PWRN2）、PCR引物購自上海吉瑪生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養基、RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；熒光實時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜和噻唑藍（MTT）試劑盒購自上海生工生物科技有 限 公 司；一 抗Klotho、TGF-β1/2、TGF-β、SALL4、p-Smad2、β-actin購自美國CST公司。

1.2 細胞培養和慢病毒感染 HEB、U-87 MG、C6、U251細胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基培養，LN382、SNB-19細胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基培養，在37℃、5%CO2條件下培養。U-87 MG細胞接種于6孔板，接種量以過夜培養后匯合度達60%為準。感染復數設定為30，以LV-NC感染U-87 MG細胞作為對照組（4個細胞），以攜帶PWRN2序列的LV-PWRN2感染的U-87 MG細胞作為試驗組（4個細胞），根據慢病毒說明書進行感染操作。12 h后更換為含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基。

1.3 qPCR檢測 運用Trizol法分別提取組織和細胞中總RNA，紫外分光光度檢測純度和濃度，以500 ng總RNA為模板反轉錄為cDNA。按照qPCR檢測試劑盒說明書擴增。以GAPDH為內參檢測PWRN2和Klotho mRNA的表達水平。qPCR數據采用2-△△CT法進行統計。qPCR引物序列：Klotho正向引物5’-GTGCGTCCATCTGGGATACG-3’，反向引物5’-TGTCGCGGAAGACGTTGTT-3’；GAPDH正向引物5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反 向 引 物5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；PWRN2正 向 引 物5’-TGAGAGGAGATTTCAGGACGTT-3’，反 向 引 物5’-CAGTTTGCTTCAAGGTTACATCC-3’。

1.4 四甲基偶氮鹽微量酶反應比色（MTT）法檢測U-87 MG細胞增殖能力 收集兩組U-87 MG細胞，采用DMEM/F12培養基制備單細胞懸液。分別以1 000個/孔接種于96孔板。分別于接種后第1、2、3、4、5天進行MTT檢測，以10μl/孔加入MTT試劑，繼續培養4 h，棄上清后每孔加入120μl二甲基亞砜，保證結晶溶解，20 min內采用酶標儀檢測在490 nm波長處每孔的吸光度（A）值，繪制U-87 MG細胞生長曲線。

1.5 細胞劃痕實驗檢測U-87 MG細胞遷移能力 收集兩組U-87 MG細胞，采用DMEM/F12培養基制備單細胞懸液并接種于6孔板。采用200μl在6孔板底部進行劃痕，采用含100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基洗3次。此時記為0 h，在100×顯微鏡下拍照，Image Pro Plus軟件測量劃痕距離A1。連續培養24 h，在100×顯微鏡下拍照，測量劃痕距離A2。計算細胞遷移率=（A1-A2）/A1×100%，代表U-87 MG細胞遷移能力。

1.6 蛋白質印記法檢測蛋白表達 收集兩組U-87MG細胞，采用RIPA細胞裂解液裂解細胞，測定總蛋白濃度后，每孔上樣40μg蛋白，以SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離蛋白，半干轉膜法轉膜至硝酸纖維素膜，封閉液中進行封閉。采用封閉液按1∶1 000稀釋所有一抗，在4℃下進行孵育過夜。采用封閉液按1∶10 000稀釋所有二抗，在室溫下進行孵育，采用增強化學發光法曝光、顯色。

1.7 統計學方法 數據分析采用SPSS21.0統計學軟件，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PWRN2在膠質瘤及癌旁組織組織中的表達qPCR檢測顯示，膠質瘤組織和癌旁組織中PWRN2表達量分別為（1.25±0.52）和（6.28±0.66），PWRN2在膠質瘤組織中低表達（P＜0.01）。

2.2 PWRN2在膠質瘤細胞株及正常腦膠質細胞中的表達 qPCR檢測顯示，5種膠質瘤細胞株（U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251）和正常腦膠質細胞株HEB中PWRN2的表達量分別為（0.13±0.02）、（0.55±0.06）、（0.73±0.07）、（0.34±0.04）、（0.47±0.03）和（1.00±0.04）。與HEB相比，PWRN2在膠質瘤細胞株中低表達（P＜0.05），在U-87 MG細胞株中表達最低（P＜0.01），故選擇U-87 MG細胞進行后續試驗。

2.3 兩組細胞中PWRN2的表達 qPCR檢測顯示，試驗組和對照組U-87 MG細胞中PWRN2的表達分別為（10.28±0.84）和（1.02±0.12），試 驗 組U-87 MG細 胞 中PWRN2的表達較對照組明顯升高（P＜0.01）。

2.4 過表達PWRN2對U-87 MG細胞增殖能力的影響 MTT法檢測兩組U-87 MG細胞的增殖能力，在第2天開始，試驗組U-87 MG細胞的吸光度較對照組明顯降低，見圖1，結果表明過表達PWRN2可抑制U-87 MG細胞的增殖能力。

圖1 四甲基偶氮鹽微量酶反應比色法檢測兩組U-87 MG細胞的增殖能力

2.6 過表達PWRN2對U-87 MG細胞遷移能力的影響 試驗組和對照組U-87 MG細胞遷移率分別為（68.41±7.62）%和（27.96±4.87）%，差異有統計學意義（P＜0.01），結果表明過表達PWRN2可降低U-87 MG細胞的遷移能力。

2.7 兩組細胞中Klotho mRNA的表達 qPCR定量檢測顯示，試驗組和對照組U-87 MG細胞中Klotho mRNA的表達量分別為（4.33±0.53）和（1.01±0.09），試驗組U-87 MG細胞中Klotho mRNA的表達較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。試驗結果表明上調PWRN2能夠促進Klotho mRNA的表達。

2.8 兩組細胞中Klotho及轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路蛋白的表達 與對照組相比，試驗組U-87 MG細胞中Klotho蛋白表達增加，TGF-β信號通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達降低，見圖2。試驗結果表明上調PWRN2可導致Klotho蛋白表達增加，TGF-β信號通路的轉導被抑制。

圖2 蛋白質印記法檢測兩組U-87 MG細胞Klotho及TGF-β信號通路蛋白的表達

3 討 論

膠質瘤長期占據顱內惡性腫瘤發病率的首位，其高轉移性和高復發性導致患者的預后較差［5］。隨著分子生物學技術的發展，基因靶向治療已成為膠質瘤重要的輔助治療方式。lncRNA可在轉錄水平、轉錄后水平調控特定基因的表達，在各種細胞分子通路中發揮重要作用，影響疾病的發生、發展［6］。越來越多的研究表明，多個lncRNA如FOXD2-AS1［7］、GATA6-AS［8］、FoxD2-AS1［9］等的 異 常 表達參與調控膠質瘤細胞的增殖、耐藥、放療敏感性、遷移等惡性生物學行為，且與膠質瘤患者的療效、復發及預后相關。PWRN2在膠質瘤中的臨床意義和生物學功能未見報道。

本研究通過檢測臨床組織標本和細胞株中PWRN2的表達，證實PWRN2高表達于膠質瘤組織和細胞株，表明PWRN2可能在膠質瘤的發生、發展中發揮重要作用。為進一步探究PWRN2的生物學功能，本研究選擇表達量最低的U-87 MG細胞，通過LV-PWRN2促進細胞中PWRN2的表達。本研究通過MTT法和細胞劃痕試驗證實，上調PWRN2表達均可明顯抑制膠質瘤U-87 MG細胞的增殖和遷移。Klotho基因位于染色體13q12，最初被認為是一種抗衰老基因［10］。Klotho蛋白屬于膜結合蛋白，在人體多個正常組織中均可表達，具有調控鈣磷代謝、氧化應激、炎性反應等作用［11］。近年研究顯示，Klotho蛋白在胃癌、結直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中低表達，Klotho表達下調導致腫瘤細胞的增殖和轉移，與腫瘤患者的生存期相關，證明Klotho基因是一種抑癌基因［12］。研究表明，膠質瘤組織中Klotho基因啟動子的甲基化程度明顯增加，Klotho蛋白的表達明顯降低，Klotho表達水平越高，膠質瘤患者的生存在越長，Klotho可能參與膠質瘤的發生和進展［13］。本研究顯示，特異性增加U-87 MG細胞中PWRN2的表達，Klotho基因的表達明顯上調，PWRN2可促進Klotho基因的表達。TGF-β信號通路是介導膠質瘤生長和轉移的重要通路之一［14］。本研究通過Western blotting檢測發現，Klotho基因表達上調后，TGF-β信號通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達明顯降低，表明TGF-β信號通路轉導被抑制。PWRN2調控Klotho基因表達的具體分子機制尚不清楚，是下一步研究的方向。

綜上所述，PWRN2在膠質瘤組織和細胞株中表達降低，上調PWRN2可抑制膠質瘤細胞U-87 MG的增殖和遷移能力，其分子機制可能是PWRN2通過促進Klotho的表達，抑制TGF-β信號通路的轉導。PWRN2可能在膠質瘤的分子診斷和基因靶向治療研究中具有重要價值。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。