lncRNA PWRN2在膠質(zhì)瘤組織中的表達及對膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移能力的影響

馬迎輝 胡勝 胡驍 吳勇 金杰

鄂東醫(yī)院集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 435000

膠質(zhì)瘤是成年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)切除、放療和化療是膠質(zhì)瘤主要的治療方法，但其整體預(yù)后較差［1］。膠質(zhì)瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移是影響其療效和預(yù)后的主要因素，探究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制有助于尋找新的治療靶點和提供膠質(zhì)瘤的診治水平［2］。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一類非編碼RNA，長度超過200個核苷酸，在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［3］。越來越多的研究證實，lncRNA參與調(diào)控腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移過程，與腫瘤患者的生存期密切相關(guān)［4］。lncRNA已成為近年來膠質(zhì)瘤研究的熱點。PWRN2屬于lncRNA家族成員，其在膠質(zhì)瘤中的表達及生物學(xué)功能并不清楚。本研究通過檢測膠質(zhì)瘤組織和細胞株中PWRN2的表達，觀察PWRN2對膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移過程的調(diào)控作用，探究PWRN2可能的作用機制，為膠質(zhì)瘤的分子診斷和基因靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本、細胞系和主要試劑 選取2018年1月至2019年12月本院神經(jīng)外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為膠質(zhì)瘤的腫瘤組織和對應(yīng)癌旁組織，組織標(biāo)本于液氮中保存。所有膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未行化療或放療。HEB、U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；陰性對照病毒（LV-NC）、PWRN2重組慢病毒（LV-PWRN2）、PCR引物購自上海吉瑪生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜和噻唑藍（MTT）試劑盒購自上海生工生物科技有 限 公 司；一 抗Klotho、TGF-β1/2、TGF-β、SALL4、p-Smad2、β-actin購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染 HEB、U-87 MG、C6、U251細胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，LN382、SNB-19細胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。U-87 MG細胞接種于6孔板，接種量以過夜培養(yǎng)后匯合度達60%為準。感染復(fù)數(shù)設(shè)定為30，以LV-NC感染U-87 MG細胞作為對照組（4個細胞），以攜帶PWRN2序列的LV-PWRN2感染的U-87 MG細胞作為試驗組（4個細胞），根據(jù)慢病毒說明書進行感染操作。12 h后更換為含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3 qPCR檢測 運用Trizol法分別提取組織和細胞中總RNA，紫外分光光度檢測純度和濃度，以500 ng總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qPCR檢測試劑盒說明書擴增。以GAPDH為內(nèi)參檢測PWRN2和Klotho mRNA的表達水平。qPCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行統(tǒng)計。qPCR引物序列：Klotho正向引物5’-GTGCGTCCATCTGGGATACG-3’，反向引物5’-TGTCGCGGAAGACGTTGTT-3’；GAPDH正向引物5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反 向 引 物5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；PWRN2正 向 引 物5’-TGAGAGGAGATTTCAGGACGTT-3’，反 向 引 物5’-CAGTTTGCTTCAAGGTTACATCC-3’。

1.4 四甲基偶氮鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測U-87 MG細胞增殖能力 收集兩組U-87 MG細胞，采用DMEM/F12培養(yǎng)基制備單細胞懸液。分別以1 000個/孔接種于96孔板。分別于接種后第1、2、3、4、5天進行MTT檢測，以10μl/孔加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入120μl二甲基亞砜，保證結(jié)晶溶解，20 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀檢測在490 nm波長處每孔的吸光度（A）值，繪制U-87 MG細胞生長曲線。

1.5 細胞劃痕實驗檢測U-87 MG細胞遷移能力 收集兩組U-87 MG細胞，采用DMEM/F12培養(yǎng)基制備單細胞懸液并接種于6孔板。采用200μl在6孔板底部進行劃痕，采用含100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基洗3次。此時記為0 h，在100×顯微鏡下拍照，Image Pro Plus軟件測量劃痕距離A1。連續(xù)培養(yǎng)24 h，在100×顯微鏡下拍照，測量劃痕距離A2。計算細胞遷移率=（A1-A2）/A1×100%，代表U-87 MG細胞遷移能力。

1.6 蛋白質(zhì)印記法檢測蛋白表達 收集兩組U-87MG細胞，采用RIPA細胞裂解液裂解細胞，測定總蛋白濃度后，每孔上樣40μg蛋白，以SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉液中進行封閉。采用封閉液按1∶1 000稀釋所有一抗，在4℃下進行孵育過夜。采用封閉液按1∶10 000稀釋所有二抗，在室溫下進行孵育，采用增強化學(xué)發(fā)光法曝光、顯色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PWRN2在膠質(zhì)瘤及癌旁組織組織中的表達qPCR檢測顯示，膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中PWRN2表達量分別為（1.25±0.52）和（6.28±0.66），PWRN2在膠質(zhì)瘤組織中低表達（P＜0.01）。

2.2 PWRN2在膠質(zhì)瘤細胞株及正常腦膠質(zhì)細胞中的表達 qPCR檢測顯示，5種膠質(zhì)瘤細胞株（U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251）和正常腦膠質(zhì)細胞株HEB中PWRN2的表達量分別為（0.13±0.02）、（0.55±0.06）、（0.73±0.07）、（0.34±0.04）、（0.47±0.03）和（1.00±0.04）。與HEB相比，PWRN2在膠質(zhì)瘤細胞株中低表達（P＜0.05），在U-87 MG細胞株中表達最低（P＜0.01），故選擇U-87 MG細胞進行后續(xù)試驗。

2.3 兩組細胞中PWRN2的表達 qPCR檢測顯示，試驗組和對照組U-87 MG細胞中PWRN2的表達分別為（10.28±0.84）和（1.02±0.12），試 驗 組U-87 MG細 胞 中PWRN2的表達較對照組明顯升高（P＜0.01）。

2.4 過表達PWRN2對U-87 MG細胞增殖能力的影響 MTT法檢測兩組U-87 MG細胞的增殖能力，在第2天開始，試驗組U-87 MG細胞的吸光度較對照組明顯降低，見圖1，結(jié)果表明過表達PWRN2可抑制U-87 MG細胞的增殖能力。

圖1 四甲基偶氮鹽微量酶反應(yīng)比色法檢測兩組U-87 MG細胞的增殖能力

2.6 過表達PWRN2對U-87 MG細胞遷移能力的影響 試驗組和對照組U-87 MG細胞遷移率分別為（68.41±7.62）%和（27.96±4.87）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明過表達PWRN2可降低U-87 MG細胞的遷移能力。

2.7 兩組細胞中Klotho mRNA的表達 qPCR定量檢測顯示，試驗組和對照組U-87 MG細胞中Klotho mRNA的表達量分別為（4.33±0.53）和（1.01±0.09），試驗組U-87 MG細胞中Klotho mRNA的表達較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。試驗結(jié)果表明上調(diào)PWRN2能夠促進Klotho mRNA的表達。

2.8 兩組細胞中Klotho及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路蛋白的表達 與對照組相比，試驗組U-87 MG細胞中Klotho蛋白表達增加，TGF-β信號通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達降低，見圖2。試驗結(jié)果表明上調(diào)PWRN2可導(dǎo)致Klotho蛋白表達增加，TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。

圖2 蛋白質(zhì)印記法檢測兩組U-87 MG細胞Klotho及TGF-β信號通路蛋白的表達

3 討 論

膠質(zhì)瘤長期占據(jù)顱內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的首位，其高轉(zhuǎn)移性和高復(fù)發(fā)性導(dǎo)致患者的預(yù)后較差［5］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因靶向治療已成為膠質(zhì)瘤重要的輔助治療方式。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控特定基因的表達，在各種細胞分子通路中發(fā)揮重要作用，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展［6］。越來越多的研究表明，多個lncRNA如FOXD2-AS1［7］、GATA6-AS［8］、FoxD2-AS1［9］等的 異 常 表達參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的增殖、耐藥、放療敏感性、遷移等惡性生物學(xué)行為，且與膠質(zhì)瘤患者的療效、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)。PWRN2在膠質(zhì)瘤中的臨床意義和生物學(xué)功能未見報道。

本研究通過檢測臨床組織標(biāo)本和細胞株中PWRN2的表達，證實PWRN2高表達于膠質(zhì)瘤組織和細胞株，表明PWRN2可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為進一步探究PWRN2的生物學(xué)功能，本研究選擇表達量最低的U-87 MG細胞，通過LV-PWRN2促進細胞中PWRN2的表達。本研究通過MTT法和細胞劃痕試驗證實，上調(diào)PWRN2表達均可明顯抑制膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞的增殖和遷移。Klotho基因位于染色體13q12，最初被認為是一種抗衰老基因［10］。Klotho蛋白屬于膜結(jié)合蛋白，在人體多個正常組織中均可表達，具有調(diào)控鈣磷代謝、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等作用［11］。近年研究顯示，Klotho蛋白在胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中低表達，Klotho表達下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與腫瘤患者的生存期相關(guān)，證明Klotho基因是一種抑癌基因［12］。研究表明，膠質(zhì)瘤組織中Klotho基因啟動子的甲基化程度明顯增加，Klotho蛋白的表達明顯降低，Klotho表達水平越高，膠質(zhì)瘤患者的生存在越長，Klotho可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展［13］。本研究顯示，特異性增加U-87 MG細胞中PWRN2的表達，Klotho基因的表達明顯上調(diào)，PWRN2可促進Klotho基因的表達。TGF-β信號通路是介導(dǎo)膠質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要通路之一［14］。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，Klotho基因表達上調(diào)后，TGF-β信號通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達明顯降低，表明TGF-β信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。PWRN2調(diào)控Klotho基因表達的具體分子機制尚不清楚，是下一步研究的方向。

綜上所述，PWRN2在膠質(zhì)瘤組織和細胞株中表達降低，上調(diào)PWRN2可抑制膠質(zhì)瘤細胞U-87 MG的增殖和遷移能力，其分子機制可能是PWRN2通過促進Klotho的表達，抑制TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PWRN2可能在膠質(zhì)瘤的分子診斷和基因靶向治療研究中具有重要價值。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。