小檗堿介導的抗腦缺血凋亡通路研究進展

田 悅，王 奇，羅玉敏

0 引言

腦缺血具有高發病率、高死亡率、高致殘率的特點，同時也給社會帶來了巨大的經濟負擔，對人類健康造成了很大影響。在各種腦卒中疾病中，缺血性腦卒中所占比例超過80%[1-2]。其原因多是由于動脈管腔狹窄和血栓形成，以及血管痙攣等原因，進而引起大腦的缺血缺氧反應，患者多會出現偏癱、偏身感覺障礙、偏盲、意識障礙等臨床表現。當前，臨床上多采用靜脈溶栓療法治療腦缺血。重組組織纖溶酶原激活劑(Recombinant tissue-type plasminogen activator,r-tPA)具有可觀的溶栓作用，是目前被批準使用的一類用于治療急性腦缺血的藥物，但該藥必須在發病后3～4.5 h的治療時間窗內應用方可達到理想療效，臨床上僅有少數患者能夠接受該治療。相比之下，對腦缺血患者進行相應的神經保護治療顯得至關重要[3-5]。腦缺血后的病理損傷，一般與細胞內鈣離子失衡、興奮性中毒、自由基介導的細胞毒性、炎癥反應、神經元凋亡、血腦屏障破壞等有關，近年來在神經保護的基礎實驗中，研究方向大多與鈣通道阻滯劑、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、自由基清除劑、抗炎藥、抗凋亡劑、抗氧化劑等相關[6]。有文獻報道，在腦缺血后進行神經保護治療，可減少神經元細胞的死亡，延長治療時間窗[7]。傳統的神經保護治療一般采用單一機制干涉，無法從多方面干預腦缺血患者的病理生理級聯反應[8]。而且由于人與實驗動物大腦結構功能的差異性、臨床治療時間窗的限制、臨床治療期間血藥濃度的差異性、臨床實驗觀察指標的差異性及臨床實驗的設計缺陷等因素，神經保護藥物在基礎醫學研究階段有一定療效，但在臨床實驗中則鮮有成功[6]。因此，目前尚無有效的神經保護藥物可應用于臨床。隨著對腦缺血研究的深入，迫切需要新的治療藥物以延長治療時間窗，減少神經元丟失，促進腦缺血后神經功能的恢復。近年有研究表明，利用小檗堿對腦缺血動物模型進行干預，能夠顯著減少腦梗死體積，減輕腦水腫，發揮神經保護作用[9]。

小檗堿，又名黃連素，是從傳統中藥黃連中提取出的一種季胺型異喹啉生物堿。近年研究表明，小檗堿具有良好的抗腫瘤、降血脂、治療糖尿病、抗動脈粥樣硬化、抗腦缺血、神經保護、抗炎、抗凋亡等作用[10-15]。本綜述總結了近年來研究發現的小檗堿抗腦缺血凋亡相關通路及相關機制，為進一步研究小檗堿的抗腦缺血作用提供思路。

1 腦缺血后的細胞死亡方式

腦缺血會導致缺血核心區的神經元細胞死亡，同時，缺血半暗帶區的神經元也受到相應的損傷，隨著時間的推移亦會逐漸死亡[16]。隨著缺血后再灌注的恢復，將會為大腦帶來更加嚴重的損害，稱為缺血/再灌注損傷[17]。一系列的反應，均會引起神經功能的進一步損傷[18-19]。因此，腦缺血后，神經元細胞多是以死亡而告終。常見的細胞死亡方式有壞死、凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡、自噬性細胞死亡、鐵死亡等[20-21]。但在腦細胞的眾多死亡方式中，目前研究最多的是神經元凋亡。

2 小檗堿對凋亡相關基因的影響

腦缺血發生后，會引發一系列的炎癥反應，導致神經元細胞損傷，而神經元細胞的損傷則進一步加劇了神經元凋亡，如何保護缺血區與缺血半暗帶區的神經元細胞免受凋亡，促進大腦神經功能恢復，發揮腦保護作用，是治療腦缺血的關鍵點[22]。細胞凋亡是指在各種刺激下誘導的、受基因調控的程序性死亡，具有主動耗能的特點[23]。神經元細胞凋亡涉及眾多凋亡相關基因，研究較多的為B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)與半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。其中，Bcl-2是重要的抗凋亡相關基因，Bax為促凋亡基因[24-27]。Caspase-3為凋亡執行的關鍵因子[28-30]。本綜述以小檗堿影響抗凋亡基因為切入點，論述小檗堿的神經保護作用。

3 小檗堿對腦缺血凋亡通路的影響

3.1 小檗堿通過Akt/GSK3β/ERK抗凋亡信號通路發揮神經保護作用 蛋白激酶B(Akt)是一種由生長因子調控的絲氨酸/蘇氨酸激酶，磷酸化的Akt具有抗凋亡作用[31-32]。絲氨酸/蘇氨酸糖原合成酶激酶-3(GSK3β)在中樞神經系統中含量豐富，磷酸化GSK3β對神經細胞具有各種調節功能[33]。細胞外調節蛋白激酶(ERK)為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員[34]，磷酸化ERK能夠發揮相應的神經保護作用[35]。在中樞神經系統疾病中，磷酸化Akt/GSK3β/ERK可以通過抑制Caspase-3的表達，減少細胞凋亡，進而發揮抗凋亡作用[36-37]。同時，磷酸化Akt/GSK3β/ERK，能夠減少神經毒性，保護神經元細胞，發揮相應的神經保護作用[38-40]。

有研究采用熒光圖像分析碘化丙啶(PI)攝取來評估缺氧缺糖(OGD)處理的腦缺血大鼠細胞損傷，通過Western blot分析Akt、GSK3β、ERK和JNK在腦缺血大鼠腦內的表達，借助熒光底物Ac-DEVD-AFC裂解法測定Caspase-3活性。結果發現，大鼠腦缺血后磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)及磷酸化ERK(p-ERK)表達顯著減少，Akt、GSK3β及ERK表達顯著增加，大鼠腦內Caspase-3活性增高，細胞凋亡增多，而小檗堿則能夠逆轉這一現象。同時，小檗堿治療后，PI攝取減少，證明細胞凋亡減少，該研究表明，小檗堿可以通過抑制大鼠腦缺血后Caspase-3的活性表達，減少細胞凋亡，發揮神經保護作用，且該作用涉及Akt/GSK3β/ERK信號通路[41]。

Zhang等[42]采用Longa評分法[43]對永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)腦缺血大鼠進行神經功能缺損評分，用標準干/濕重法測定腦含水量，采用TTC染色法測定大鼠腦缺血后梗死體積，采用免疫組化法測定大鼠腦缺血后腦內p-GSK3β、p-Akt的表達，采用Western blot法測定大鼠腦缺血后腦內Akt、p-Akt、GSK3β及p-GSK3β的表達。結果顯示，小檗堿治療能夠顯著降低大鼠神經功能缺損評分，發揮神經保護作用，顯著降低大鼠腦含水量與腦梗死體積，顯著上調p-GSK3β、p-Akt的表達，該研究表明小檗堿對缺血性神經損傷的保護作用涉及Akt/GSK3β信號通路。

3.2 小檗堿通過PI3K/Akt抗凋亡信號通路發揮神經保護作用 磷酸肌醇3激酶(PI3K)是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，磷酸化PI3K具有神經保護作用[44]。

在蒙古沙鼠腦缺血研究中，Kim等[45]以跳臺回避任務實驗評估短暫性全腦缺血沙鼠的短期記憶，采用免疫組化法測定沙鼠全腦缺血后Caspase-3的表達，利用Western blot分析測定沙鼠全腦缺血后PI3K、Akt、Bax、Bcl-2的表達。研究結果發現，腦缺血導致沙鼠短期記憶功能顯著下降，使其海馬磷酸化PI3K(p-PI3K)及p-Akt表達顯著減少，PI3K以及Akt表達顯著增多，同時，蒙古沙鼠腦海馬區的Caspase-3與Bax表達顯著升高，Bcl-2表達顯著減少，而小檗堿治療可以顯著減輕缺血誘導的沙鼠短期記憶功能損害，逆轉凋亡相關因子Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達，增加PI3K與Akt的磷酸化表達，發揮神經保護作用。該研究表明,小檗堿通過激活PI3K/Akt信號通路抑制神經元凋亡，發揮其抗缺血性損傷的神經保護作用。

在大鼠腦缺血研究中，Hu等[46]采用PC12細胞與大鼠腦海馬的原代神經元缺氧缺糖處理方式，用MTT法測定小檗堿對PC12細胞缺氧缺糖的保護作用，用流式細胞術分析細胞凋亡，借助Western blot檢測缺氧缺糖處理PC12細胞后p-Akt、總Akt和Caspase-3下游凋亡信號的時間依賴性變化，同時，測定雙側頸總動脈缺血再灌注模型大鼠腦內p-Akt以及Caspase-3的表達，利用實時逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測PI3K 與PI3K調節亞單位p55γ的mRNA水平。結果顯示，小檗堿以劑量依賴的方式顯著提高了細胞活力與細胞存活率，顯著降低了細胞Caspase-3的積累，促進Akt磷酸化，上調了PI3K調節亞單位p55γ的表達。同時，小檗堿的治療可顯著上調腦缺血再灌注大鼠腦內p-Akt的表達，抑制Caspase-3的表達。在使用PI3K抑制劑Ly294002與Akt抑制劑Akti-1/2后，小檗堿的細胞保護作用則被抑制，該研究表明，小檗堿通過PI3K/Akt信號通路發揮神經保護作用。

3.3 小檗堿通過SIRT1抗凋亡信號通路發揮神經保護作用 沉默信息調節因子2相關酶-1(SIRT1)在中樞神經系統中具有重要的保護作用，有研究表明，腦缺血后，SIRT1受到抑制，使其抗凋亡作用減弱，而激活SIRT1后，則能夠發揮相應的神經保護作用[47-49]。

為探討小檗堿預處理對腦缺血大鼠的影響，王博等[50]采用Longa 評分法對腦缺血再灌注大鼠進行神經功能缺損評分，采用Western blot檢測大鼠腦缺血再灌注后大腦內Bcl-2、Bax以及Caspase-3的表達，研究結果顯示，接受小檗堿預處理的腦缺血再灌注大鼠，神經功能缺損評分顯著下降，大鼠腦組織中 Bcl-2 的表達顯著增多，Bax與Caspase-3的表達顯著減少，表明小檗堿能夠抑制大鼠腦缺血再灌注損傷過程中的細胞凋亡。在聯合使用 SIRT1 抑制劑 EX527 后，發現小檗堿對凋亡相關基因Bcl-2、Bax及Caspase-3的作用被抑制。該研究提示，小檗堿能夠抑制腦缺血再灌注過程中的細胞凋亡，發揮神經保護作用，而該過程涉及SIRT1抗凋亡通路。

3.4 小檗堿通過HIF-1與p53抗凋亡信號通路發揮神經保護作用 缺氧誘導因子-1(HIF-1)是一種轉錄因子，是氧穩態的重要調節因子。Chen等[51]研究發現，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)能夠在體外直接結合mdm2癌基因，但卻不能與p53抑癌基因在體外直接結合。不過，mdm2表達可以顯著增強p53和HIF-1α在體內結合，表明mdm2可能在HIF-1α與p53之間起到橋梁作用，促進二者在細胞中相互作用。同時，HIF-1可以增加p53的穩定性，HIF-1能夠通過與p53泛素連接酶mdm2結合來調節Bax等凋亡相關蛋白，從而誘導程序性細胞凋亡。此外，在中樞神經系統中，p53的表達具有促凋亡作用，而抑制其表達，則是發揮神經保護作用的關鍵點[52]。

Zhang等[53]采用Western blot檢測大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織內HIF-1α及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，采用TUNEL檢測法和免疫組織化學法檢測大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織細胞凋亡程度與HIF-1α及p53的表達。結果發現，腦缺血后大鼠腦內HIF-1α和p53表達顯著增多，而小檗堿可以顯著逆轉這一現象。同時，小檗堿預處理也顯著降低了大鼠腦缺血后腦組織內細胞凋亡程度，顯著增加了Bcl-2的表達，減少了Bax與Caspase-3的表達。該研究表明小檗堿能夠通過下調HIF-1α和p53的表達，進而抑制大鼠腦缺血后神經元凋亡，發揮神經保護作用。

4 小結

綜上所述，小檗堿主要通過Akt/GSK3β/ERK、PI3K/Akt、SIRT1、HIF-1/p53信號通路，影響凋亡相關基因，增加Bcl-2的表達[45,50,53]，減少Bax的表達[45,50,53]，抑制Caspase-3的表達[41,45-46,50,53]，從而發揮相應的神經保護作用。

目前，腦缺血仍是威脅人類生命安全的醫學難題，尋找對腦缺血患者更好的神經保護治療方法，是眾多科學家努力的方向。小檗堿可能成為一種神經保護候選藥，其改善血腦屏障通透性的特性，使其在腦缺血神經保護方面具有巨大的潛力[42]。研究發現，經小檗堿預處理的腦缺血模型，能夠顯示出預防腦缺血、保護神經元免受缺血缺氧損害、改善神經功能缺損的良好作用[54-55]。同時，小檗堿所具有的良好的抗神經元細胞凋亡作用，使其在神經保護方面具有更大的優勢。此外，研究發現，正常劑量下小檗堿具有很小的毒性與副作用[56]。因此，將小檗堿作為抗腦缺血的理想藥物，可能會發揮良好的神經保護作用。但目前對小檗堿的認識還不夠全面，小檗堿還有更多的藥理作用亟待研究與開發，如何讓小檗堿以最佳的抗凋亡通路發揮神經保護作用并保證其安全性，還需要在今后的研究中進一步探索。