辣椒素通過調節GRP78觸發內質網應激對人急性髓系白血病HL-60細胞凋亡的影響

張友弟，張 樂，江 明

0 引言

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成人最常見的白血病類型，也是最難治療的血液系統惡性腫瘤之一(成人原發性AML的5年總生存率是20%～30%)[1-2]。AML的特征是分化障礙和不受控制的增殖[3]。AML的發病率逐年增長，盡管目前的療法取得了進步，但是易復發仍然是臨床上的關鍵問題。內質網(Endoplasmic reticulum,ER)是重要的細胞器，負責蛋白質的生物合成和折疊、細胞和鈣的動態平衡。目前，ER被認為是最新發現的調節細胞凋亡的新焦點[4]。多種刺激可能會導致ER紊亂，包括鈣代謝紊亂、氧化應激和蛋白質合成增強，這些統稱為ER應激[5]。已有研究報道了ER的功能及其參與AML中的相關應激途徑[6]。因此，靶向凋亡和內質網應激可能對開發有效的白血病治療方法有啟示作用。辣椒素(Capsaicin,Cap)是辣椒屬植物辣椒中主要的刺激性成分，該化合物主要存在于辣椒和辣椒的白髓和膜中[7]。研究表明，辣椒素具有調節心血管系統、鎮痛止癢、抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、清除自由基等作用[8]。本研究觀察辣椒素對HL-60細胞的凋亡是否有促進作用，其作用機制是否與GRP78觸發內質網應激有關，并進一步探討其作用機制，為臨床治療AML提供新的理論依據。

1 實驗材料

1.1 細胞 人急性髓系白血病細胞系HL-60購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，辣椒素和兔抗人GRP78抗體購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國promega公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司，Salubrinal(ER應激抑制劑)購自美國MCE公司，LipofectamineTM 3000購自美國Invitrogen公司，ShGRP78和shScramble購自上海吉瑪制藥技術有限公司，鼠抗人GAPDH抗體購自美國Biovision公司，山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 酶標儀購自美國Bio-Tek公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國Beckman-Coulter公司，Gel Doc XR+凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 HL-60細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養，2 d更換一次培養基，以保證細胞所需的營養成分。當傳代3次后，可以進行后續的實驗。

2.2 CCK-8檢測辣椒素毒性 HL-60細胞以3×103個/孔種到96孔板中，每孔100 μl。細胞分為：0 μmol/L辣椒素組[Cap(0)組]、10 μmol/L辣椒素組[Cap(10)組]、20 μmol/L辣椒素組[Cap(20)組]、40 μmol/L辣椒素組[Cap(40)組]、60 μmol/L辣椒素組[Cap(60)組]和80 μmol/L辣椒素組[Cap(80)組]，每組3個復孔。置于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將10 μl CCK-8試劑加到每個孔中。2 h后使用酶標儀在450 nm處測量每孔細胞的OD值，計算細胞活力。

2.3 Wright-Giemsa染色 將HL-60細胞以5×104個/孔密度接種于12孔培養板，加入相應濃度的辣椒素孵育24 h后，更換為無血清培養基。HL-60細胞用Wright試劑處理并培養24 h，PBS沖洗2次。HL-60細胞經固定后，用Giemsa試劑染色。最后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞并拍照。

2.4 Salubrinal預處理HL-60細胞 以1×105個/孔接種于24孔板，用Salubrinal(15 μmol)預處理2 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)處理24 h。實驗結束后，收集細胞進行后續實驗。

2.5 細胞轉染 按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書將50 ng的shGRP78和shScramble分別轉入HL-60細胞中。在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養6 h后，更換新鮮的培養基繼續培養。48 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)處理24 h。實驗結束，收集細胞進行后續實驗。

2.6 細胞流式術 各組細胞用冰PBS沖洗1次，在加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI后再用300 μl緩沖液重懸，將細胞在避光的室溫下孵育10 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，并使用CellQuest軟件分析數據。

2.7 Western blot RIPA裂解液提取HL-60細胞的總蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：兔抗人GRP78抗體(1∶1 000)、兔抗人GAPDH抗體(1∶2 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

3 結果

3.1 辣椒素的濃度篩選 CCK-8結果表明(圖1)，用不同濃度的辣椒素(0、10、20、40、60和80 μmol/L)處理HL-60細胞24 h后，HL-60細胞的細胞活力受到辣椒素濃度的影響。當辣椒素濃度為40、60、80 μmol/L時，HL-60細胞的細胞活力在50%左右(P<0.001)，因此，后續實驗辣椒素的濃度選擇40、60、80 μmol/L。

圖1 CCK-8用于檢測不同濃度的辣椒素對HL-60細胞活力的影響

3.2 辣椒素對HL-60細胞形態的影響 Wright-Giemsa染色結果表明(圖2)，經不同濃度辣椒素處理后的HL-60細胞出現：染色質濃集，呈半月狀或指環狀，線粒體腫脹、空泡樣變、內質網擴張等變化；隨著辣椒素濃度的增加，HL-60細胞的數目逐漸減少。

圖2 Wright-Giemsa染色觀察不同濃度的辣椒素對HL-60細胞形態的影響

3.3 辣椒素對HL-60細胞凋亡的影響 細胞流式術結果表明(圖3)，經不同濃度辣椒素處理后的HL-60細胞，其細胞凋亡率隨著辣椒素濃度的增加而增加(P<0.001)。提示辣椒素顯著誘導了HL-60細胞的凋亡。

圖3 Annexin V-FITC/PI雙重染色方法用于檢測不同濃度的辣椒素對HL-60細胞凋亡的影響

3.4 辣椒素對內質網應激信號傳導的影響 Western blot結果表明，GRP78(內質網應激反應的主要標志分子之一)蛋白的表達量隨著辣椒素濃度的升高而不斷增加(P<0.05，P<0.001，P<0.001。圖4A)。使用Salubrinal(ER應激抑制劑)預處理HL-60細胞，發現通過Salubrinal預處理可以明顯減少GRP78蛋白的表達(P<0.01。圖4B)。

圖4 Western blot檢測辣椒素對GRP78蛋白表達的影響

3.5 辣椒素通過內質網應激信號傳導對HL-60細胞凋亡的影響 流式細胞術結果表明(圖5)，Salubrinal預處理后，HL-60細胞凋亡率與辣椒素誘導HL-60細胞凋亡率下降(P<0.05)，提示辣椒素誘導的HL-60細胞凋亡依賴于ER應激。

圖5 辣椒素通過內質網應激信號傳導對HL-60細胞凋亡的影響

3.6 辣椒素對CRP78蛋白表達的影響 Western blot結果表明(圖6)，與未經任何處理的細胞組相比，辣椒素顯著增加GRP78蛋白表達(P<0.001)；辣椒素增加的GRP78蛋白表達在轉染shGRP78的HL-60細胞中下調(P<0.001)。

圖6 辣椒素對CRP78蛋白表達的影響

3.7 辣椒素通過GRP78誘導內質網應激對HL-60細胞凋亡的影響 與未經任何處理的細胞組相比，辣椒素顯著增加HL-60細胞凋亡(P<0.001)；在shGRP78轉染的HL-60細胞中，由辣椒素觸發的顯著凋亡也被消除(P<0.01)。見圖7。

圖7 辣椒素對內質網應激通過GRP78誘導的HL-60細胞凋亡的影響

4 討論

AML是起源于髓細胞前體的造血系統惡性腫瘤，是成年人中最常見的急性白血病[9]。AML是一種分子異質性疾病，通常與不良預后相關。根據細胞遺傳學和分子異常，將AML患者分為經過風險調整的化療的不同風險類別[10]。由于AML的難治愈性或復發性，60歲以下的患者很少被治愈。對于60歲以上的患者，預后更差[11-12],因此,需要新的治療方法。

辣椒素是辣椒中的主要活性成分，具有鎮痛止癢、抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、清除自由基等作用[13]，例如，辣椒素通過抑制Wnt/β-catenin途徑抑制前列腺癌干細胞的活性[14]。研究顯示，辣椒素能誘導人黑素瘤細胞凋亡和自噬[15]。本研究發現，辣椒素可使HL-60細胞出現染色質濃集，呈半月狀或指環狀等變化，且隨著辣椒素濃度的增加，HL-60細胞的數目逐漸減少；經不同濃度辣椒素處理后的HL-60細胞，其細胞凋亡率逐漸增加。

內質網應激是多種細胞生理和病理事件的關鍵調節劑，包括對抗腫瘤藥物起反應的細胞凋亡信號傳導途徑。內質網應激導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質以及3個內質網跨膜換能器的積累[16-17]。同時，內質網應激可促進Bax、Bcl-2的重要促凋亡家族成員。Bax對于調節不同刺激誘導的內在凋亡通路是必需的[18]。越來越多的研究表明，內質網應激是白血病進展的重要機制，并參與細胞凋亡的誘導[19]。本研究顯示，辣椒素顯著誘導了HL-60細胞的ER應激，使GRP78(內質網應激反應的主要標志分子之一)蛋白表達上調。應用Salubrinal(ER應激抑制劑)預處理HL-60細胞后，結果表明，通過Salubrinal預處理可以明顯減少GRP78蛋白的表達，降低HL-60細胞的凋亡率。

GRP78是細胞內質網應激的主要標志分子，在調節內質網應激中起著至關重要的作用[20]，其在維持腫瘤微環境穩定，增強腫瘤細胞存活性、侵襲性和轉移性，抵抗抗腫瘤藥物誘導的細胞凋亡等有重要作用[21]。本實驗中，沉默GRP78使辣椒素增加的GRP78蛋白表達下調；在shGRP78轉染的HL-60細胞中，由辣椒素觸發的凋亡也被消除。

綜上所述，辣椒素顯著降低HL-60細胞的細胞活力，促進其凋亡。辣椒素觸發的細胞凋亡可能取決于內質網應激，與調節GRP78的表達有關。因此，可將辣椒素用作治療AML的可選藥物，為臨床上治療AML提供新的理論依據。