基于RNA測序?qū)Ψ蜗侔┖喜⒎嗡ㄈ磉_(dá)譜的生物信息學(xué)分析

王清鶴 曹國磊 張秀華 王景 馬榮輝 羅琴

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)科，烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院體檢中心，烏魯木齊 830011

肺栓塞，也稱肺血栓栓塞癥，是以各種栓子阻塞肺動脈系統(tǒng)為發(fā)病原因的一組疾病或臨床綜合征的總稱，屬于靜脈栓塞的一種類型[1]。肺癌是我國最常見的癌癥，而肺腺癌作為肺癌中最常見的一種病理類型，是肺癌患者發(fā)生肺栓塞的獨立危險因素[2]。多個臨床研究已經(jīng)證實肺栓塞的發(fā)生與肺癌患者病死率的增加密切相關(guān)[3-4]。目前針對肺腺癌合并肺栓塞的致病相關(guān)機制尚未得到充分研究。本研究運用高通量RNA測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法篩選肺腺癌合并PE相關(guān)的差異基因，探討其發(fā)生的分子機制，為其早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 前瞻性研究。選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2019年1～12月住院的肺腺癌合并肺栓塞患者4例為肺腺癌合并肺栓塞組，男3例，女1例；年齡范圍為31～62歲，年齡(48.5±12.9)歲，中位年齡50.5歲。選取同期入院的單純肺腺癌患者4例為肺腺癌組，男2例，女2例；年齡范圍為40～75歲，年齡(58.5±15.3)歲，中位年齡59.5歲。選取同期入院的單純肺栓塞患者4例為肺栓塞組，男3例，女1例；年齡范圍為40～80歲，年齡(60.3±16.4)歲，中位年齡60.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：肺腺癌診斷由組織病理學(xué)證實，無肺栓塞病史，無重要臟器嚴(yán)重疾病。肺栓塞的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會《肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南》2018版[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有其他惡性腫瘤病史，有凝血功能障礙，近期使用過影響凝血的藥物。肺腺癌合并肺栓塞患者為肺腺癌診斷前3個月或診斷后24個月內(nèi)發(fā)生的肺栓塞。所有患者均知情同意，本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(2019BC007)。

1.2 RNA提取和測序 每例患者于入院后24 h內(nèi)采集2.5 ml靜脈血，保存于-80℃冰箱，待標(biāo)本收集完成后，使用Trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596026)按照說明書提取所獲全血總RNA。每個樣品取3μg總RNA構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫，文庫測序由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 獲取共同差異表達(dá)基因 對測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和歸一化處理后，采用R語言中的LIMMA軟件包及DESeqR軟件包分析肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組、肺腺癌合并肺栓塞組對比肺栓塞組基因的差異表達(dá)。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)|log FC|≥2；(2)P≤0.05，提取差異基因并進(jìn)行基因名注釋，繪制兩對比組差異基因火山圖，并使用Venny在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪 制 韋 恩圖，將兩對比組差異基因經(jīng)Excel軟件取交集，選擇兩對比組中共有的差異基因，稱之為共同差異基因。

1.4 基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 使用Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/gp/index.html)對篩選后的共同差異基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分 析(分 析 參 數(shù)：Min Overlap≥3，Min Enrichment≥1.5，P＜0.05)，通過Fisher Exact Test計算P值，以P＜0.05作為篩選條件。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌合并肺栓塞組、肺腺癌組及肺栓塞組差異基因表達(dá)譜 獲得差異基因后，剔除FPKM小于0的基因。在肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組中共鑒定出519個差異基因，包括357個上調(diào)基因和162個下調(diào)基因；在肺腺癌合并肺栓塞組對比肺栓塞組中共鑒定出828個差異基因，包括455個上調(diào)基因和373個下調(diào)基因。將兩對比組差異基因取交集，共得到147個共同差異基因，其中上調(diào)基因80個，下調(diào)基因67個(圖1)。按照差異倍數(shù)的對數(shù)值由大到小將共同上下調(diào)差異基因進(jìn)行排列，見表1。

圖1 肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組、肺栓塞組差異基因火山圖及韋恩圖 A：肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組差異基因火山圖；B：肺腺癌合并肺栓塞組對比肺栓塞組差異基因火山圖；C：肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組及肺腺癌合并肺栓塞組對比肺栓塞組差異基因韋恩圖

表1 肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組、肺栓塞組的共同上下調(diào)差異基因(各前5個)

2.2 差異基因GO及KEGG富集分析 將共同差異基因輸入Matescape進(jìn)行富集分析，GO分析發(fā)現(xiàn)兩對比組共同差異基因主要富集于中性粒細(xì)胞活化、軸突發(fā)育、白細(xì)胞分化、防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)控、髓系細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控等過程(圖2)。KEGG通路分析表明，共同差異基因主要參與代謝途徑、肺結(jié)核、癌癥途徑、血小板活化等通路(表2)。

圖2 肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組、肺栓塞組的共同差異基因富集的GO條目(前20條)

表2 肺腺癌合并肺栓塞組對比肺腺癌組、肺栓塞組的共同差異基因富集的KEGG通路(前10條)

3 討論

研究表明癌癥可誘導(dǎo)凝血系統(tǒng)的激活，進(jìn)而刺激腫瘤生長和擴散[5]。肺腺癌合并肺栓塞既與腫瘤相關(guān)又與栓塞聯(lián)系，其發(fā)病機制復(fù)雜且影響因素眾多。目前研究認(rèn)為肺栓塞的形成主要與凝血系統(tǒng)的激活、血管內(nèi)皮損傷、炎癥因子表達(dá)增加等機制有關(guān)，尚缺乏相關(guān)分子機制研究。本研究利用RNA測序技術(shù)對肺腺癌合并肺栓塞、單純肺腺癌以及單純肺栓塞患者外周血RNA進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共篩選出147個共同差異基因，包括80個上調(diào)基因，67個下調(diào)基因。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，兩對比組共同差異基因主要參與中性粒細(xì)胞活化、軸突發(fā)育、白細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。已有多項研究報道白細(xì)胞增多等炎癥反應(yīng)與癌癥患者患靜脈栓塞風(fēng)險增加有關(guān)[6-7]，中性粒細(xì)胞可能通過產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外陷阱來促進(jìn)血栓形成[8]。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，共同差異基因與代謝途徑、癌癥途徑、血小板活化等通路聯(lián)系密切。而有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞通過激活血小板活化誘導(dǎo)血小板聚集，這一過程與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)[9-10]，與本研究結(jié)果相類似。

本研究選擇P值最小的前5個上下調(diào)共同差異基因進(jìn)行分析，其中PRTN3是目前研究較為深入的基因。PRTN3編碼絲氨酸蛋白酶3，其誘導(dǎo)加工促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α、IL-8和IL-1β，這些因子已明確在包括肺癌的各種腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用[11-12]。絲氨酸蛋白酶3還可通過干擾巨噬細(xì)胞的激活[13]、破壞細(xì)胞外基質(zhì)[14]以及黏附中性粒細(xì)胞胞外陷阱[15]導(dǎo)致血管壞死及肺組織內(nèi)皮的損傷，內(nèi)皮損傷是血栓形成的重要機制之一。與絲氨酸蛋白酶3緊密聯(lián)系的CD177基因也是共同差異基因，CD177編碼CD177糖蛋白，在中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程中參與炎癥反應(yīng)[16]。而先前的研究發(fā)現(xiàn)CD177在胃癌中表達(dá)上調(diào)，與本研究結(jié)果相似。CD177可作為腫瘤細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)節(jié)因子[17]，使得絲氨酸蛋白酶3及CD177作為中樞將炎癥、血管組織壞死以及腫瘤的生長侵襲互相聯(lián)系了起來。本研究發(fā)現(xiàn)PRTN3、CD177為上調(diào)的共同差異表達(dá)基因，有理由認(rèn)為PRTN3及CD177可能參與肺腺癌合并肺栓塞的發(fā)病過程。

本研究中最顯著的差異上調(diào)基因為S100P。Tian等[18]用基因芯片分析鑒定了52個非小細(xì)胞肺癌的差異基因，發(fā)現(xiàn)S100P在NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中表達(dá)增強，與本研究結(jié)果一致。此外，S100P的過表達(dá)增加了NSCLC細(xì)胞皮下轉(zhuǎn)移瘤的血管生成及促進(jìn)轉(zhuǎn)移[19]，提示S100P不僅能促進(jìn)NSCLC發(fā)生，還可能通過血管生成促進(jìn)肺栓塞的發(fā)生。

HP基因已被證明與肺癌相關(guān)[20]，其在腫瘤血管生成領(lǐng)域也發(fā)揮作用[21]。Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)HP在急性肺栓塞患者的血清和肺動脈中表達(dá)上調(diào)，提示HP可能參與了急性肺栓塞的病理生理過程，可作為急性肺栓塞的潛在生物標(biāo)志物。因此，HP是探索肺腺癌合并肺栓塞患者生物學(xué)過程中一個可以考慮的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)EPHA4在肺腺癌合并肺栓塞組中為顯著下調(diào)差異基因，EPHA4基因編碼Eph受體A4蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，EPHA4基因中/高表達(dá)的NSCLC患者生存時間明顯長于陰性/弱表達(dá)的NSCLC患者(P=0.019)[23]。Saintigny等[24]在肺腺癌亞組中，EPHA4的表達(dá)與患者總生存期呈正相關(guān)，提示其可能是一種腫瘤抑制因子，該研究中還發(fā)現(xiàn)EPHA4減少了細(xì)胞遷移和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中EPHA4的缺失可以增加血管平滑肌細(xì)胞的收縮性，從而導(dǎo)致高血壓表型[25]，提示EPHA4對于血管內(nèi)皮有一定調(diào)控作用，而EPHA4是否在肺腺癌合并肺栓塞過程中起作用，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了肺腺癌合并肺栓塞患者的差異表達(dá)基因(CD177、S100P、HP、EPHA4、PRTN3等)和肺腺癌合并肺栓塞患者差異表達(dá)基因富集的多條通路(代謝途徑、癌癥途徑、血小板活化等)。未來的研究將進(jìn)一步驗證及探索這些基因在肺腺癌合并肺栓塞患者中的表達(dá)水平、肺腺癌合并肺栓塞發(fā)病過程中的生物學(xué)功能，以及參與的通路與肺腺癌合并肺栓塞發(fā)病機制之間的關(guān)聯(lián)，以改善和提高肺腺癌合并肺栓塞的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突