放射性肺損傷機制及干細胞治療研究進展

牛世英 楊彤 張月英

山東第一醫科大學基礎醫學院，濟南 250062

放射性肺損傷(radiation-induced lung injury，RILI)是對胸部的惡性腫瘤進行放射治療引起的并發癥，最多見于對肺癌、乳腺癌的放療。在放療過程中可使病變周圍的肺組織因接受到超過其閾值的放射劑量導致產生不可逆性的損傷。RILI的輕重隨著放射劑量、放射部位和放射的范圍不同而有差異。大面積、高劑量的放療，RILI的發生率和嚴重程度大。RILI的病理變化包括兩個階段：早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纖維化。雖然放療技術的有所發展，但接受胸部放射治療的患者仍有30%會發生RILI。RILI的發生涉及多種因素，現普遍認為是射線導致Ⅱ型肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷產生的多細胞因子級聯的結果，從而引起炎癥和纖維化。

1 RILI的機制

1.1 細胞損傷 當肺暴露于射線時，首先出現的反應就是細胞損傷，包括內皮細胞和上皮細胞。上皮細胞和內皮細胞損傷時，其完整性被破壞，隨后會有一系列細胞因子被釋放，以至于大量內容物和炎性細胞集聚于肺泡腔，從而引起炎癥反應。炎癥反應的長期不斷刺激導致纖維化的發生。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在生物體進化、內環境的穩定以及系統發育中起著重要作用。同時，細胞凋亡也存在于病理情況下。有研究表明，射線引起RILI的過程中，細胞凋亡起著重要作用。以下是射線引起的幾種細胞的凋亡。

1.1.1 血管內皮細胞 血管內皮細胞位于血管內壁的單層扁平上皮，構成了血管組織間屏障的重要成分，在血管生成、收縮與舒張中起著重要的作用。有研究發現，血管內皮細胞是輻射敏感細胞，照射劑量一旦超過其閾值，血管內皮細胞便會發生損傷，最主要的結果就是凋亡反應，之后便會引起細胞因子瀑布反應，導致炎性細胞和內容物滲出，激發炎癥反應；同時，炎性細胞和內容物的不斷刺激導致纖維化形成[1]。并且射線導致血管內皮細胞損傷，屏障功能受到破壞，血管通透性增強，大量的炎癥因子從受損細胞中釋放，從而引起炎癥反應[2]。此外，當肺部接受射線照射后，會引起氧自由基的產生[5]，誘導血管內皮細胞的凋亡。因此血管內皮細胞凋亡在細胞損傷中起著重要作用。

1.1.2 肺泡上皮細胞 射線照射后，肺泡上皮細胞發生損傷，主要是Ⅱ型肺泡上皮細胞發生凋亡，從而導致肺泡塌陷，促進纖維化的發展。其次，研究發現，射線照射后，肺實質細胞中促凋亡基因Bax表達增加，凋亡抑制因子Bcl-2表達減少；同時間質細胞凋亡抑制因子Bcl-2表達增加，表明促凋亡基因和凋亡抑制基因的不平衡表達在肺纖維化過程中可能起重要的作用[3]。研究還發現，肺泡上皮細胞數量的減少導致成纖維細胞過度增生，從而發生纖維化；而且Ⅱ型肺泡上皮細胞的凋亡也會影響Ⅰ型肺泡上皮細胞[4-6]。此外，最近的研究表明，肺泡上皮細胞可以通過上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程轉化為肌成纖維細胞，并且肺泡上皮細胞發生EMT已在人類特發性肺纖維化和實驗性肺纖維化中得到證實[7-8]。

1.2 肺泡巨噬細胞聚集 肺部接受射線照射可引起肺泡上皮細胞和內皮細胞損傷，從而導致的大量炎癥因子釋放，招募炎細胞聚集在損傷部位，進一步擴大炎癥反應。同時，接受射線照射的肺泡巨噬細胞會引起活性氧的產生，促進巨噬細胞向M1表型轉化，引起炎癥反應[9-10]。其次巨噬細胞也可通過釋放轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)導致成纖維細胞的激活，最終誘發肺纖維化[5]。

1.3 細胞因子釋放 細胞因子在RILI發生中倍受關注，受損細胞會釋放細胞因子和趨化因子，促進炎性細胞遷移到受損部位，募集在受損部位的炎性細胞會分泌許多細胞因子，如IL-6、腫瘤壞死因子α、TGF-β1和IL-1α等。這些細胞因子在放射性肺炎和纖維化的發展中發揮關鍵作用[11]。

TGF-β1是與放射性肺纖維化發生和發展密切相關的細胞因子，是一類具有調控細胞周期、早期發育、分化、免疫功能及誘導凋亡的多功能細胞因子。大量體內體外試驗證明TGF-β1在細胞凋亡中發揮了重要作用，其可以誘導多種細胞發生凋亡[3，5]。在肺組織中，肺泡上皮細胞通過釋放TGF-β1導致纖維化發生，并且TGF-β1又可通過抑制巨噬細胞分泌的胰島素樣生長因子1來促使上皮細胞凋亡，從而加速纖維化的進程。TGF-β1還參與成纖維細胞的增殖和分化，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，導致肺纖維化，同時參與EMT的誘導[12]。因此，TGF-β1在放射性纖維化發生、發展中起到重要作用。

IL-6是具有多種功能的細胞因子，參與調節急性炎性反應。IL-6可由多種細胞產生，包括B細胞、T細胞、單核巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞以及腫瘤細胞。有研究發現照射區肺組織中的IL-6 m RNA水平明顯上調[13]。因此，IL-6參與了放射性肺炎的發生。

1.4 基底膜破壞 基質金屬蛋白酶(matrixmetallo proteinases，MMPs)是一類蛋白水解酶，能特異的降解細胞外基質，參與了多種纖維化疾病的發展過程，其在放射性肺纖維化中的作用也引起人們的注意，尤其以MMP-2、MMP-9較重要。在RILI發生時，檢測到MMP-2、MMP-9的表達上調，兩者可以降解Ⅳ型膠原(基底膜的成分)，因此導致了基底膜破壞。基底膜破壞可能促進膠原蛋白的沉積，從而促進了放射性肺炎向纖維化進展。但具體的調節機制仍然不清楚[8，14]。

1.5 氧化應激 當肺一旦暴露于射線下，就會發生氧化應激反應，產生氧自由基和活性氧。氧自由基是人體內水產生的，具有很強的破壞性，可以破壞各種化學鍵和DNA雙鍵，是一種有害物質。這些氧自由基和活性氧損害肺組織，尤其是上皮細胞和內皮細胞，使細胞凋亡和上皮屏障功能破壞，導致RILI的發生。實驗證明，射線照射后肺內產生的大量活性氧可以直接破壞蛋白質并產生羥基自由基，進而引起DNA損傷[15-16]。此外，活性氧可以破壞線粒體DNA并誘導炎癥和免疫反應[17-18]；還可導致細胞丟失，增加上皮細胞的血管通透性、蛋白質滲出和細胞凋亡[5]。

2 干細胞治療

干細胞是具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞。而所謂干細胞治療，就是利用人體干細胞的分化和修復原理，把健康干細胞移植到患者體內，以達到修復病變細胞和重建功能正常的細胞和組織的目的。目前，臨床上主要采用自體干細胞移植，無免疫排斥及交叉感染，是一種簡單、安全的治療方法。現就利用間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療RILI作一敘述。

2.1 概述 MSCs是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層，具有自我復制能力和多向分化潛能，可誘導分化為脂肪、軟骨及其他組織類型細胞。MSCs可以接受移植，并且他們在部分組織中會遷移到病變部位分化為組織特異性功能的細胞，例如肺上皮細胞[19，21]，平滑肌細胞[20-21]。已有實驗證明，MSCs利用細胞因子分泌與分化等特性修復損傷的組織器官[21-22]。

2.2 優點 MSCs的優勢可概括為以下4個方面：(1)容易獲得；(2)可以歸巢并植入受損組織；(3)具有廣泛的增殖和分化能力；(4)免疫原性低。正因為這幾大優勢，MSCs可以成功地跨越免疫屏障移植。越來越多的研究證明MSCs治療肺損傷存在2個主要優點：(1)MSCs可以參與調節免疫反應，促進抗炎；(2)MSCs可以在全身給藥后遷移到損傷部位，它們中的一部分會分化成相應的組織細胞以替代損傷的肺組織，促進肺組織的修復[23]。先前MSCs與輻射肺活檢組織共培養的體外實驗證明了MSCs可以分化為上皮細胞的能力，雖然MSCs具有分化的能力，但它們在組織中很快被免疫系統清除，且可以通過分泌細胞因子來促進組織修復[24]。

2.3 用于治療RILI的MSCs分類及其治療機制

2.3.1 骨髓MSCs治療RILI的機制 骨髓MSCs是骨髓內存在的一類非造血干細胞，其在體內外具有支持和調控造血的作用，并且在體內可分布于多種組織和器官，具有多向分化潛能，因此目前其在醫學上難以攻克的一些疾病方面具有重大應用潛力。骨髓MSCs在治療RILI中可能存在的機制有以下幾點。(1)具有抗輻射特性。有學者在小鼠組織中研究了骨髓MSCs對輻射的反應，骨髓MSCs具有更高的體外存活率和抗輻射能力[21]。骨髓MSCs通過產生抗氧化酶(如超氧化物歧化酶1、3，錳超氧化物歧化酶)降低氧化應激和活性氧水平，保護肺免受輻射誘導的內皮損傷。此外，有實驗證明骨髓MSCs在缺氧條件下抗輻射特性更加顯著[25]。(2)具有高效的修復系統。電離輻射可導致DNA雙鏈斷裂直接破壞DNA結構，也可通過產生活性氧間接影響基因組DNA和線粒體DNA結構，損害DNA分子[26]。因此，放射治療會導致不同形式的DNA損傷。其中最嚴重的是DNA雙鏈斷裂。研究表明，骨髓MSCs具有高效的DNA雙鏈損傷修復系統[20，27]。(3)抑制上皮細胞EMT。先前有文獻報道，存在于腫瘤環境中的MSCs可以促進癌細胞EMT[28]，例如乳腺癌[29]、胃癌[30]。一些MSCs整合到腫瘤中時受腫瘤微環境的影響，會轉化為腫瘤相關MSCs，腫瘤相關MSCs會通過微環境的調節顯示出更強的腫瘤促進能力，并且通過微環境中的分泌因子促進癌細胞EMT[28]。然而在炎癥病灶中，MSCs通過旁分泌刺激對鄰近細胞顯示出有益的作用[20]。有研究報道，受傷的肺組織保留了骨髓MSCs在肺中的滯留，且骨髓MSCs能夠在肺中分泌多種細胞因子，通過上調細胞因子的表達減輕局部損傷，刺激上皮細胞增殖，抑制上皮細胞EMT[23，25，31]。而且骨髓MSCs可釋放高水平的生長因子，如VEGF，有利于傷口的愈合[23]。(4)下調內皮細胞MMP-2的表達。Klein等[32]發現電離輻射后引起內皮細胞MMP-2表達上調，破壞血管結構，而MSCs可以減少內皮細胞MMP-2表達水平，使血管功能正常化，減輕血管結構的破壞。

2.3.2 人臍帶MSCs治療RILI的機制 臍帶在臨床上屬于醫療廢物，來源廣泛，取材方便，分化潛力大，增殖能力強，具有明顯的優勢。人臍帶MSCs能抑制腫瘤的生長及轉移，同時能減輕肝纖維化和腎損傷[33-34]。而其在治療RILI中可能存在的機制有以下幾點。(1)降低IL-1的水平。在發生RILI時IL-1、TGF-β1等短暫升高已在小鼠模型中證實，并且IL-1有促進炎癥和纖維化的作用，可加重病情[23]。有研究證明，人臍帶MSCs能抑制單核巨噬細胞分泌IL-1，降低IL-1的水平可以減輕RILI的進展[35]。但MSCs抑制IL-1分泌的機制還不清楚。(2)合成IL-10。IL-10是由單核巨噬細胞產生的體內強有力的抗炎因子，它能抑制巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的活性，抑制Th1反應，并促進抗炎分子的分泌，抑制炎癥反應，促進肺組織的修復，減輕RILI的進展[25，36]。人臍帶MSCs進入體內可以合成和分泌IL-10，提高抗炎因子的水平。然而，IL-10也是最有爭議的細胞因子，關于其在MSCs中的分泌存在矛盾的結果[21]。(3)抑制肺泡上皮細胞EMT。Wnt信號通路在細胞分化和增殖中起著至關重要的作用，TGF-β1和Wnt信號通路之間的協同作用可以誘導肺泡上皮細胞經歷EMT[35]。Zhang等[37]進一步研究了人臍帶來源的MSCs和Wnt通路之間的聯系，并發現正常的肺成纖維細胞與臍帶來源的MSCs的共培養削弱了Wnt/β-連環蛋白信號的激活，并且張春陽等[38]通過研究也發現MSCs可抑制放射線照射后小鼠肺組織內Wnt/β-catenin信號通路的活化。因此Wnt/β-連環蛋白信號成為了減弱RILI的潛在治療靶點。

2.3.3 人脂肪MSCs治療RILI的機制 人脂肪MSCs通過分泌前列腺素E2(prostagandin E2，PGE2)和肝細胞生長 因 子(hematopoietic growth factor，HGF)下 調TGF-β1

[25]。人脂肪MSCs分泌的HGF可能通過結合c-Met增加細胞內Smad7的水平，并通過以PI3K/Akt/p70依賴的方式上調損傷部位MMP-1、MMP-3和MMP-9的表達，從而促進肌成纖維細胞的凋亡，抑制EMT[23]。Dong等[39]也觀察到人脂肪MSCs可以通過分泌HGF來保護Ⅱ型肺泡上皮細胞免受輻射誘導的EMT。人脂肪MSCs分泌的PGE2可促進抗炎因子IL-10的產生。此外，PGE2可抑制TGF-β1誘導活化的成纖維細胞增殖，并且PGE2還通過增加阻斷PI3K/Akt信號通路的PTEN蛋白活性誘導肌成纖維細胞凋亡。這些發現表明，人脂肪MSCs通過激活抗炎通路和旁分泌因子的方式抑制纖維化[23，40]。

Jiang等[40]發現，人脂肪MSCs可以降低血清IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α水平，下調照射肺組織中TGF-β1和1型膠原水平來緩解RILI。

3 小結與展望

RILI是多因素造成的結果，表現為照射后引起多種靶細胞損傷，細胞損傷后立即引起細胞因子釋放、氧化應激等現象，最終導致細胞凋亡。MSCs取材簡單，分化潛能大，增殖能力強，免疫原性低，可作為靶向細胞應用于臨床，是治療RILI的重要部分。

雖然MSCs已經被越來越多的用于許多疾病的治療，但其用于RILI的具體機制還不是很清楚，MSCs治療后主要表現為炎癥反應降低，纖維化緩解。然而，MSCs也可能促進組織纖維化。在輻射后立即注入肺中的MSCs會分化為功能性的肺細胞，但在輻射后后期再注入就可能參與纖維化的發展，推測與后期微環境改變和TGF-β1水平升高有關[41]。因此，MSCs治療RILI的時間窗也是至關重要的。

值得注意的是，無癥狀的放射性肺炎的RILI通常在嚴重纖維化發展的晚期被診斷出來，這可能很難用MSCs有效逆轉。因此，基于MSCs的RILI治療的潛在臨床應用仍有很長的路要走。就RILI而言，我們仍然需要評估MSCs治療的安全性、最佳劑量、給藥時間和給藥途徑。此外，MSCs在實驗動物中的治療效果并不總是顯示出令人滿意的結果，因此還需要大量的實驗去探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突