動靜脈血循環腫瘤細胞檢測在肺癌診治中的意義及應用

梁衛娟 厲為良 高鵬帥 王亞旭

浙江大學明州醫院呼吸疾病診療中心，寧波 315000

肺癌已經成為當前主要的公共衛生問題之一。根據鄭榮壽等[1]統計分析，2015年我國男性肺癌新發病例52萬，發病率73.90%(1/10萬)，居所有腫瘤首位，女性肺癌新發病例26.7萬，發病率39.78%(1/10萬)，居第二位；按死亡人數順位排序，2015年我國肺癌死亡人數約為63.1萬例，病死率為45.87%(1/10萬)居于我國惡性腫瘤死亡第1位。目前，盡管在癌癥治療方面取得了飛快進展，但肺癌的總體5年生存率仍不到20%[2]。大多數肺癌患者確診時已處于晚期，導致了高病死率。CTCs檢測是一種新興的液體活檢技術，在腫瘤的早期診斷、個體化治療等方面有較廣泛的應用，本文就CTCs簡要介紹、檢測技術、在肺癌中的應用及其在動靜脈血中的差異等方面作如下綜述。

1 簡述CTCs及檢測

1.1 CTCs介紹 早在1869，澳大利亞學者Ashworth在轉移性癌癥患者血液中發現一種與原發腫瘤細胞基本相似的細胞，并提出了循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念[3]。CTCs來源于原發實體腫瘤或轉移灶，其主動或被動獲得脫離基底膜的能力，并侵入及通過組織基質層，最后進入血管。腫瘤細胞脫落進入血循環后，大部分因機體的免疫監控或血流剪切、氧化應激、自身凋亡等原因在短期內死亡，只有極少部分活性高、轉移潛性能強的CTCs能夠存活下來，進而在遠處靶器官中定植形成轉移灶[4]。CTCs是局部疾病的大使，在血液中以單個或成群的方式運行，可在遠處器官形成新的病變。此外，CTCs可能在轉移部位仍處于休眠狀態，并在稍后時間被激活，從而導致復發[5-6]。

循環腫瘤微栓子是數個細胞聚集成團進入血循環的團塊。相比CTCs，它更能抵御“失巢凋亡”和免疫清除，有更強的生存優勢，對細胞毒性藥物的耐受性也相對更強[7]。惡性腫瘤細胞為了獲得更強的侵襲和運動能力，會丟失一些上皮細胞的表型，并通過某些特定程序獲得一些間質細胞的表型，即上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。近年研究證據表明，多數惡性腫瘤脫離原發灶進行轉移的過程中發生了EMT，發生EMT的癌細胞會上調多種蛋白質酶，降解細胞外基質，提高自身侵襲性[8]。CTCs中也有EMT發生，造成上皮細胞特異性分子[上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep CAM)、細胞角蛋白等]陰性表達，而間質細胞特異性分子標志物陽性率增加，這些細胞也具有更強的生存優勢和轉移潛能[9]。循環腫瘤微栓子主要通過EMT轉化避免“失巢凋亡”，保持增殖能力。

CTCs與原發腫瘤或轉移瘤分離、脫落，進入患者血液，是相對容易獲得的腫瘤組織樣本。對CTCs的探索和研究可以為臨床提供大量的相關信息，反映疾病的實際、實時情況[10]。

1.2 CTCs檢測技術 CTCs在血流中是非常罕見的，大約每1個CTC散落于數百萬(106～107)個正常單核白細胞之中[10-11]。因此，為了能夠研究和評估CTCs的數量和特征，其檢測方法需要有足夠強的敏感度及非常高的特異度。目前常用的肺癌CTCs檢測方法有以下幾種。

1.2.1 CellSearch技術 CellSearch技術已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床，也是多年來唯一被批準的。它依賴于EpCAM在靶細胞表面的表達[12]，該上皮標志物結合單克隆抗體(MAb)，通過抗原抗體反應，使所有表達EpCAM的細胞都與與磁性珠結合，通過磁選從溶液中剔除。捕獲的細胞用細胞角蛋白(陽性檢測)、CD45(陰性檢測)和DAPI染色進行成像[13]。迄今為止，該系統得到了廣泛應用，并為其他CTCs分離技術的比較設定了標準。該試驗將每7.5 ml外周血中檢測到的5個CTCs切斷作為預測可行的指標。有研究發現，CellSearch技術是一種可行的預測乳腺、前列腺、非小細胞肺癌和其他上皮性腫瘤轉移、無進展生存和整體存活的指標[12]。該檢測技術的局限性主要在于敏感度低，無法檢測EpCAM陰性腫瘤細胞。

1.2.2 CTC-chip技術 CTC-chip技術與CellSearch技術的基本原理相同。CTC-chip技術在其基礎之上，再利用微流體學原理，在硅片上設置了78 000個微柱位點。當包含有Ep CAM抗原的CTCs流經位點時，可以被位點捕獲，繼而再利用細胞免疫化學技能對其進行檢測分析。這項技術的顯著優點是不用預處理就能使用整個外周血，一旦細胞在微柱位點上被捕獲，就會被細胞角蛋白染色而變成可視化，以進行計數[14]。

1.2.3 ISET聯合激光掃描細胞計數儀技術 此技術主要利用ISET富集原理，依據CTCs直徑與其他血細胞及淋巴細胞直徑的差異(CTCs直徑＞10μm，而紅細胞、白細胞、淋巴細胞直徑＜8μm)，采用孔徑為8μm的濾膜過濾預先固定的外周血，分離出腫瘤細胞，然后對濾過膜進行熒光標記，最后對被熒光標記的腫瘤細胞掃描計數。該方法的優點是能有效捕獲有活力的腫瘤細胞，包括EpCAM陰性的腫瘤細胞；而且價格低廉、操作簡便。缺點是直徑較小的CTCs會被漏檢，而且缺乏形態學統一鑒定標準[15]。

1.2.4 免疫磁珠負向富集聯合受體靶向PCR檢測 葉酸受體是一種細胞表面受體糖蛋白，在多種癌癥(尤其是卵巢癌和肺癌)中高表達，已成為非小細胞肺癌患者重要的潛在藥物靶點[16]。除了CTCs或活化的單核細胞[17]外，在循環系統中沒有發現表達葉酸受體的細胞。

免疫磁珠負向富集聯合受體靶向PCR檢測技術利用負向富集的原理，通過帶有磁珠的CD45抗體、CD14抗體分別標記白細胞和巨噬細胞，進而分離去除這兩種細胞以負向富集CTCs。而后，在標本內加入腫瘤特異性葉酸受體-寡核苷酸耦合物探針標記，最后進行熒光定量PCR擴增分析。該技術的優點是對EpCAM陰性的腫瘤細胞依然有效，同時也避免了漏診和假陽性，彌補了CellSearch技術、ISET技術的缺陷，目前已在肺癌檢測中開展并有較大收獲[18]。

1.2.5 陰性富集聯合熒光原位雜交技術檢測 利用白細胞表面抗原(如CD45)的特異性抗體與白細胞結合，將結合后的白細胞分離，從而分離出CTCs，稱為陰性富集。通過該方法篩選出的全部種類CTCs保留了其完整特性，有利于后續分析，但純度不夠。熒光原位雜交技術是利用標記熒光素的核酸探針檢測CTCs，該技術的敏感度及特異度均更高。將差相富集法和腫瘤標記免疫熒光染色與FISH結合，將會獲得一種更優化的檢測方式，可不依賴腫瘤上皮細胞表面表達的相關標志物，同時行腫瘤標志物染色、染色體計數雙重計數。這種方法大大提高金額檢測的敏感度及特異度，但能否應用于臨床，需更多的研究數據支撐[19]。

1.2.6 CTCs體外培養 雖然近年來CTCs檢測技術發展迅速，種類多樣，但各有優缺點，在臨床應用中未達標準化。且其主要應用局限于簡單的計數方面，不能鑒別各CTCs亞群，也不能明確具有活性的CTCs來自哪一個亞群。進入外周血CTCs都部分或完全發生了EMT，如何對于這部分微量的CTCs進行分子分析及相關功能研究面臨著艱難的技術挑戰。因此，對極少數目的侵襲和轉移活性的CTCs實現有效的體外擴增可完成這一技術挑戰。有眾多學者致力于該技術的研究：Zhang等[20]采用微流體裝置捕獲早期肺癌患者CTCs，然后與成纖維細胞在三維基質中原位共培養，但最終無法獲得純的CTCs；Yu等[21]通過CTC-Chip差相富集CTCs，并嘗試了多種的體外培養條件，成功有限。由此可見，雖然CTCs的體外培養在CTCs生物學特性研究、精確治療等方面前景廣闊，但技術上面臨諸多困難，大部分技術在樣本初處理、富集以及培養過程中都會對CTCs造成不可逆的損傷。

2 CTCs檢測對肺癌的臨床意義

2.1 肺癌的早期篩查及早期診斷 即使在腫瘤發展的早期階段，血液中也可以檢測到CTCs[22]，因此，它們可能成為癌癥篩查的手段之一。在健康人或良性腫瘤患者的血液中，被歸類為CTCs的細胞非常罕見。在肺癌方面，有學者試圖將CTCs評估與既定的篩選方法結合起來。He等[23]著重于提高低劑量CT篩查方案的特異性，將其與隨后的CTCs評估相結合，通過對比低劑量CT篩查已確定的肺“磨玻璃”結節患者和健康對照者的CTCs計數，發現只有少數肺結節患者的血液中有CTCs，但隨后的分子分析發現這些CTCs具有“惡性傾向”。可見，將低劑量CT篩查方案與CTCs結合可以提高其特異性。還有一些學者對COPD患者的CTCs水平進行了評估，在168例患者中有5例(3%)檢測出CTCs的患者都在4年內罹患肺癌；此外，在監測期內無CTC陰性患者患上癌癥[24-25]。由此可見，CTCs檢測有助于肺癌的早期篩查、診斷和早期干預，提高治愈率及生存期。

2.2 肺癌分期、轉移及疾病進展監測 血行轉移是造成肺癌患者病情進展、復發直至死亡的主要原因。研究發現，即便腫瘤直徑≤1 cm也可能發生轉移，而無臨床轉移病灶的早期肺癌患者，外周血中也可以檢測到CTCs[26]。雖然血液中檢測到CTCs就能判定患者一定發生了轉移，但很多研究顯示肺癌CTCs計數與腫瘤分期明顯相關[26-27]。CTCs計數和計數變化是評估癌癥是否進展的基本但有效的指標，CTCs計數已被證明是包括肺癌在內的許多癌癥類型的預后預測指標[28]。CTCs計數是一種能夠實時評估疾病發展的工具，相比臨床病理活檢具有創傷小、可重復性強等優點。術后或化療后CTCs計數的下降可能是疾病緩解的跡象；相反，CTCs計數的增加意味著疾病的進展，需要重新評估，選擇新的治療方案[29]。

2.3 肺癌的個體化治療 臨床上腫瘤治療方案的選擇主要依據腫瘤的TNM分級和患者的綜合評分。目前，只有極少部分的早期患者可僅接受手術治療，其他絕大部分的中、晚期患者無論能否手術，均需接受其他治療(如化療、放療、分子靶向治療及免疫治療)或聯合治療。由于不能對原發腫瘤是否進展或是否發生復發轉移進行預估，故無法選擇合適的治療方案，從而延誤治療。CTCs計數和分子分型能夠精確地預測療效，判斷預后；同時，還可作為一種實時活檢工具，為肺癌的個體化治療提供更多、更精準的依據[30]。多項研究表明，檢測患者外周血CTCs對評估化學治療、放射治療等多種不同肺癌治療方法均有意義[31-32]。此外，外周血CTCs檢測還可用于后續的腫瘤基因分析，為分子靶向治療提供一定依據[33]。

3 CTCs檢測應用于臨床存在的問題

雖然很多研究證實CTCs在肺癌等腫瘤診療中應用廣泛，但由于其在外周血中的稀有性，導致其檢測困難。目前已有眾多學者致力于多種檢測方法的研究，但由于標準范圍的難確定性，仍然只有CellSearch技術被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床，因其敏感度及特異度不高，導致CTCs臨床推廣使用困難。原發腫瘤釋放數以萬計的腫瘤細胞入血，卻只有不到0.01%的CTCs能在外周血中存活并且形成轉移[34]。Allard等[35]利用CellSearch技術對99例肺癌樣本進行檢測，發現分別有20%、14%、10%、6%的外周血樣本中CTCs數目(個)≥2、≥5、≥10、≥50。Devriese等[36]用免疫磁珠負向富集法表明，46例非小細胞肺癌患者外周血中有21例(46%)存在CTCs，46例健康對照組中有3例(7%)可查到CTCs。在另一項研究中，Hofman等[37]以ISET富集法表明，外周血CTCs的存在與腫瘤的分期和腫瘤組織學無關。以上研究均說明，CTCs在患者外周靜脈血中的存在提供了一個不完整的、非常有限的信息，尚不足以在臨床中使用。

4 肺癌動靜脈CTCs含量及空間異質性的機制探討

由于外周靜脈采血相對簡單且易被患者所接受，目前對CTCs的認識大多來自外周靜脈血，這可能只是其循環過程中的一次快照，不能代表整個循環過程。有學者對73例原發性肝癌患者在腫瘤切除前分別從周圍靜脈、外周動脈、肝靜脈、下腔靜脈和門靜脈抽血檢測CTCs，數據表明CTCs在循環過程中其細胞分布和生物學特征存在著明顯空間異質性，不同部位CTCs的測量有助于揭示肝癌轉移的新機制，預測術后復發或轉移模式等[38]。為了證實血管中的高剪切應力可能導致CTCs的EMT表型，這些學者還制作了一個微流控系統，研究動脈和靜脈剪切力對肝癌CTCs的影響，結果表明，在動脈剪切力條件下，EMT轉錄因子在5 min內開始上調，與靜脈剪切力條件下相比，差異有顯著性(P＜0.05)，其他間充質表型信號在動脈剪切力條件下循環30 min后開始增加，而上皮表型相關信號在循環30 min后開始下調。這些結果表明CTCs在通過動脈血管時即激活了EMT程序[38]。

Terai等[39]調查了17例葡萄膜黑色素瘤患者股總動脈和前肘靜脈配對血液標本中CTCs的數量，CTCs采用標準CellSearch進行分析，結果所有股總動脈標本均檢出CTCs，而在同一患者的靜脈血標本中，僅9/17(52.9%)可檢出CTCs，動脈血與外周靜脈血比較差異有統計學意義(P＜0.001)。以上研究表明，不同部位血管中CTCs分布不同；與動脈血相比，外周靜脈循環中的CTCs明顯下降，這意味著靜脈血標本可能不是檢測患者CTCs的合適來源。由于腫瘤細胞在周圍靜脈系統循環時可能凋亡和碎裂[40]，導致外周靜脈血與動脈血中的CTCs不一樣，甚至更脆弱。

眾所周知，肺組織血供來源于體循環和肺循環，且生理狀態下肺循環占絕對優勢。有研究證明肺癌分別接受體循環(支氣管動脈)及肺循環(肺動脈)的供血，肺循環供血在早期肺癌中尤其明顯[41]。由于肺癌獨特的肺靜脈引流的特點，肺靜脈中CTCs含量明顯提高，特別是在早期肺癌[42]。因此，肺靜脈CTCs檢測可以提高早期肺癌CTCs的檢測率。根據肺循環特點，肺靜脈中為動脈血，未經肺循環系統的微循環經過左心系統直接進入體循環的外周動脈系統，因此，外周動脈血中CTCs含量應接近肺靜脈血，而肺靜脈血抽取困難(需在手術中留樣)，臨床應用受限。抽取外周動脈血方便、創傷小，更利于臨床應用；而外周靜脈血要經過體循環系統的微循環過濾，CTCs會有衰減。類似的是，經支氣管靜脈入血的CTCs需經過肺循環系統的微循環及體循環系統的微循環兩層過濾才能至外周靜脈，期間會伴有更明顯的CTCs衰減。根據以上研究及理論，推斷肺癌患者動脈血中CTCs含量可能會明顯高于靜脈血，而且動脈血中的CTCs也已經發生了EMT，當然這需要相關的研究去證實。

5 動靜脈中肺癌CTCs含量的臨床意義

CTCs的研究注重于CTCs計數和CTCs特征兩方面。CTCs計數是系統治療后的反應標志物之一，可早期發現患者的微轉移及復發；而CTCs分子表征則有助于評估腫瘤異質性，以檢測其耐藥性分布，明確藥物靶點。肺癌CTCs的研究是目前臨床研究的熱點之一，但是根據某些特定生物標志物(如EpCAM)的CTCs研究發現，肺癌CTCs檢出率、檢出量與肝細胞癌、乳腺癌等其他癌癥相比均有下降[43]。CTCs數量取決于被檢血液樣本的容量和所應用的技術，并最終影響各種統計結果的準確性。靜脈采血是一種簡單、微創的方法，這種方法使許多癌癥患者都能很容易地接受CTCs檢測。由于一些CTCs在血液循環時可能被隔離或破壞，或由于技術原因可能在分析過程中丟失，導致外周靜脈CTCs的檢出率很低，限制了其在臨床中的推廣使用，所以在肺癌等腫瘤中，靜脈血CTCs的測定價值可能受限。前文已經提到，在不同的血液來源中，CTCs的分布及異質性也可能不同，肺癌動脈血中的CTCs含量可能大大高于靜脈血，其生物學特性與分子表達與靜脈血也不相同。而且動脈血中的CTCs受血液剪切力影響較小，受損較輕，更易于體外培養，如能通過研究證實，將大幅度提高CTCs檢測的敏感度，并能初步構建肺癌患者CTCs時間和空間等分布模型，提高對CTCs異質性的認識，并了解其轉移機制，掌握其藥敏及耐藥性等，使其能在臨床上獲得更多、更廣泛地應用，讓更多的肺癌等腫瘤患者獲得早期診斷及更有效的治療。

綜上所述，CTCs檢測在肺癌早期篩查診斷、轉移復發評估、個體化治療等應用方面得到進展。雖然目前CTCs檢測方法多樣，但由于其在靜脈血中的稀有性限制了其在臨床上的廣泛應用；研究對比動靜脈中肺癌CTCs差異性，有望打破這種局限性，使其獲得臨床上的廣泛應用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突