端粒酶基因多態(tài)性與乳腺癌化療耐藥性的關(guān)聯(lián)研究

趙慶麗，曾潮寧，張鋒軍

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州雅華生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730050）

端粒酶是一種能延長端粒末端的反轉(zhuǎn)錄DNA合成酶，主要由人端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相關(guān)蛋白（TEP1）、人端粒酶催化亞單位（hTRT）3部分組成[1]。近年來許多研究都已證實(shí)端粒酶與腫瘤之間的相關(guān)性，如TERT基因的rs2853669（-245T＞C）位點(diǎn)不僅與肺癌患病風(fēng)險的增加有關(guān)，還可有效降低乳腺癌的患病風(fēng)險[2]；TERC基因rs10936599位點(diǎn)的C等位基因與TERT基因rs10069690位點(diǎn)的T等位基因都與肺癌的患病風(fēng)險增加相關(guān)[3]；TERC基因的rs35073794和TERT基因的rs10069690位點(diǎn)與腎細(xì)胞癌的患病風(fēng)險相關(guān)[4]。端粒在耐藥性中的作用目前尚不清楚，大多數(shù)研究主要集中在端粒酶活性和端粒長度上，但這些發(fā)現(xiàn)仍然存在爭議。已發(fā)現(xiàn)由抗癌藥物或輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂會增加TRF2的表達(dá)，它可作為DNA損傷的早期指標(biāo)，可抑制ATM依賴性DNA損傷應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的活化，表明TRF2可能是一種DNA修復(fù)因子而不僅僅是端粒結(jié)合因子。在耐藥細(xì)胞中若通過RNA干擾抑制TRF2表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)它的抗性表型，表明TRF2在DNA損傷應(yīng)答中起重要作用，并參與胃癌的耐藥性[5]。Deschatrette等[6]在培養(yǎng)肝癌細(xì)胞對甲氨蝶呤（MTX）和順鉑耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的耐藥性可能是間歇性的，并且耐藥性的出現(xiàn)由端粒的長度決定。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在不依賴端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的情況下，TERT可通過減少骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS來抑制順鉑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以此來對抗耐藥性的產(chǎn)生。

目前，大多數(shù)研究認(rèn)為某些藥物（如多柔比星、順鉑或5-氟尿嘧啶）敏感性增加與癌細(xì)胞中端粒酶的表達(dá)下降或活性抑制相關(guān)。然而，由端粒酶改變所引起的抵抗機(jī)制仍然是一大難題。有研究認(rèn)為，它可能與端粒縮短、基因組不穩(wěn)定、hTERT易位、線粒體功能調(diào)節(jié)甚至ABC家族基因表達(dá)改變有關(guān)[8]。目前對于端粒酶在乳腺癌耐藥中的研究較少，本文通過對乳腺癌化療耐藥性與端粒酶基因上SNP（多態(tài)性）關(guān)聯(lián)的研究，以期為臨床個體化用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取的234例樣本來自2013年9月至2017年4月期間在我院住院的患者。所有樣本都經(jīng)臨床確診并接受過以蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的化療方案治療至少2次，所有樣本信息完整。本研究采集的所有樣本及收集的臨床資料均獲得本人或其法定監(jiān)護(hù)人的知情同意并簽署知情同意書，獲蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。依據(jù)國際衛(wèi)生組織確定的實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)將化療療效評價分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)綜合評價后，本研究將CR和PR歸為敏感組，SD和PD歸為耐藥組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 嚴(yán)格按照血液基因組DNA非柱式提取試劑盒（北京天根）的說明書進(jìn)行外周血基因組DNA的提取，采用NanoDrop 2000分光光度計進(jìn)行DNA濃度的測定。

1.2.2 端粒酶相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)的選擇 通過查閱文獻(xiàn)確定與耐藥發(fā)生可能相關(guān)的端粒酶基因，通過使用Hapmap、1000 Genomes及Ensembl數(shù)據(jù)庫對這些基因上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選出可能與乳腺癌耐藥相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

1.2.3 SNP基因檢測與分型 SNP位點(diǎn)的基因分型使用質(zhì)譜芯片法，根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計引物，以該SNP位點(diǎn)為中心選取長度在100 bp以上的一段基因，應(yīng)用Assay Design 3.1軟件（Sequenom公司，美國）設(shè)計反應(yīng)所需要的引物，所用引物序列見表1。此步驟由北京博淼生物科技有限公司完成。

表1 SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.4 Hardy-Weinberg平衡檢測 對各位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測，由χ2檢驗(yàn)確定差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。對不符合Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)予以排除，不進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計分析。

1.2.5 SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析和單體型分析 采用Haplowiev 4.2軟件進(jìn)行單體型分析，在分析單體型時，若構(gòu)建的單體型在樣本中的頻率小于3%，則在分析時予以排除。用SHE sis軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，計算連鎖不平衡指數(shù)D'，若D'=0，說明完全無連鎖不平衡；若0＜D'＜0.3，不存在連鎖不平衡；若0.3≤D'＜0.5，存在輕度連鎖不平衡；若 0.5≤D'＜0.8，存在中度連鎖不平衡；若0.8≤D'＜1，則存在強(qiáng)連鎖不平衡；若D'=1，為完全連鎖不平衡。

1.2.6 統(tǒng)計分析 臨床資料和分型結(jié)果運(yùn)用SPSS 22.0軟件，使用χ2檢驗(yàn)、Fisher's精確檢驗(yàn)（當(dāng)樣本量＜5時）進(jìn)行各位點(diǎn)結(jié)果分析，計算P值，P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 評價端粒酶與化療耐藥性相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)

比較敏感組與耐藥組TEP1、TERT和TERC的基因型分布和等位基因頻率。基因型和等位基因相對風(fēng)險度通過計算比值比（OR）和相應(yīng)的95%置信區(qū)間（95%CI）進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本特征分析

對乳腺癌化療樣本的基本信息進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表2。樣本總?cè)藬?shù)234人，其中敏感組157人，占67.1%；耐藥組77人，占32.9%。兩組在年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)分期、ER、C-erbB-2 的分布上都無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；但在組織學(xué)類型、PR及分子分型上兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 入選患者的臨床特征

2.2 SNP等位基因質(zhì)譜分型結(jié)果

TEP1基因rs2678685位點(diǎn)具有G和T 2種等位基因，TT、GT、GG 3種基因型；rs1713449位點(diǎn)具有C和T 2種等位基因，CC、TC、TT 3種基因型；rs1760897位點(diǎn)具有A和G 2種等位基因，AA、AG、GG 3種基因型；rs872072位點(diǎn)具有G和A 2種等位基因，GG、GA、AA 3種基因型；rs938886位點(diǎn)具有G和C 2種等位基因，GG、GC、CC 3種基因型。TERT基因rs33954691、rs2735940位點(diǎn)都具有G和A 2種等位基因，GG、GA、AA 3種基因型。TERC基因rs2293607位點(diǎn)具有T和C 2種等位基因，TT、CT、CC 3 種基因型。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測

敏感組TEP1基因rs2678685、rs1713449、rs1760897位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡檢測，χ2分別為0.814、0.098、0.266，P值均大于0.05。耐藥組TEP1基因rs2678685、rs1713449、rs872072、rs938886位點(diǎn)基因型頻率符合 Hardy-Weinberg 平衡檢測，χ2分別為 0.478、0.257、0.309、0.249，P 值均大于0.05。敏感組與耐藥組TERT基因rs33954691、rs2735940位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢測，敏感組TERT 基因 rs33954691、rs2735940 位點(diǎn) χ2分別為 0.067、0.241；耐藥組 TERT基因 rs33954691、rs2735940位點(diǎn) χ2分別為0.202、0.938，P值均大于0.05。敏感組與耐藥組TERC基因rs2293607位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡檢測，敏感組與耐藥組χ2分別為0.801、0.257，P值均大于0.05。

2.4 SNP位點(diǎn)與乳腺癌化療敏感性的關(guān)聯(lián)分析

對乳腺癌化療患者端粒酶基因TEP1、TERT、TERC上的多態(tài)性位點(diǎn)基因分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：TERT基因上的rs33954691位點(diǎn)在敏感組中的GG、AG、AA基因型數(shù)量及頻率分別為 101（64.3%）、45（28.7%）、11（7.0%）；在耐藥組中3種基因型數(shù)量及頻率分別為 37（48.1%）、36（46.8%）、4（5.2%）。與野生型基因GG相比，AG基因型在敏感組和耐藥組之間的分布有顯著差異（P=0.008，OR=0.458，95%CI=0.257～0.816），AA基因型在敏感組和耐藥組之間的分布無顯著差異（P=1.000，OR=1.007，95%CI=0.302～3.361）。在敏感組和耐藥組中A等位基因與野生G等位基因相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.084，OR=1.475，95%CI=0.948～2.294）。其他基因位點(diǎn)在敏感組和耐藥組中無顯著差異（P＞0.05）。

表3 端粒酶基因多態(tài)性位點(diǎn)在敏感組和耐藥組的基因型和等位基因頻率[n（%）]

2.5 端粒酶TEP1基因連鎖不平衡分析和單體型分析

由于TERC、TERT只有1個或2個位點(diǎn)，無法做連鎖和單體型分析，而 TEP1 基因的 rs1713449、rs872072、rs2678685、rs1760897、rs938886位點(diǎn)都位于14號染色體，在上述相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上對這5個位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。結(jié)果顯示：rs938886與rs1713449（D'=0.924）之間存在強(qiáng)連鎖不平衡；rs1760897與rs2678685（D'=0.630）之間存在中度連鎖不平衡；rs938886 與 rs872072（D'=0.383）和 rs872072 與 rs1713449（D'=0.389）之間存在輕度連鎖不平衡。對這5個位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示：G CAAG、TTGGC這兩種單體型在敏感組和耐藥組中的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，OR=3.348，95%CI=1.487～7.540；P=0.012，OR=4.491，95%CI=1.246～16.182），并且為一種危險因素，攜帶這兩種單體型的患者使用化療藥物時發(fā)生耐藥的風(fēng)險會分別增高3.3、4.5倍。

表4 乳腺癌患者TEP1基因單體型分析

3 討論

3.1 端粒酶基因TERT的rs2735940位點(diǎn)與乳腺癌的患病風(fēng)險無相關(guān)性

盡管很多乳腺癌患者在術(shù)前應(yīng)用化療藥物后，腫瘤的體積縮小，但臨床治療過程中還是會出現(xiàn)療效不佳的情況，主要原因往往是在治療過程中出現(xiàn)了耐藥情況。目前對于腫瘤在化療過程中出現(xiàn)耐藥機(jī)制的研究很多，但由于腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制極其復(fù)雜，不僅與腫瘤的病理類型、臨床分期等有關(guān)，還與個體的遺傳因素相關(guān)。目前許多研究認(rèn)為，端粒長度可作為癌癥風(fēng)險的生物標(biāo)志物。幾項(xiàng)病例對照研究發(fā)現(xiàn)，較短的端粒與癌癥如膀胱、食管、胃、頭頸部、肺、卵巢和腎臟等相關(guān)[9-10]。雖然乳腺癌中對端粒長度的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果不一致，但大多數(shù)研究支持長的端粒與乳腺癌的風(fēng)險相關(guān)。此外還有研究證實(shí)，編碼端粒相關(guān)蛋白基因中的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）可以通過影響端粒中的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)構(gòu)造來影響端粒長度和染色體穩(wěn)定性。在土耳其和伊朗東南部關(guān)于端粒酶TERT基因rs2735940位點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)性的研究中，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與乳腺癌的患病風(fēng)險相關(guān)[11-12]，這與我們的研究結(jié)果一致。但另一項(xiàng)研究通過對TERT基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)評價分析發(fā)現(xiàn)，雖然rs2735940與乳腺癌無相關(guān)性，但對激素受體表達(dá)情況分析后發(fā)現(xiàn)，rs2735940位點(diǎn)與ER-/PR-的乳腺癌患者之間具有相關(guān)性。表明在乳腺癌中該關(guān)聯(lián)可能受激素受體狀態(tài)和遺傳修飾的雙重調(diào)節(jié)。

3.2 端粒酶基因TERT的rs33954691位點(diǎn)AG基因型與乳腺癌化療敏感性相關(guān)

目前許多研究發(fā)現(xiàn)了端粒酶、端粒長度在耐藥發(fā)生過程中發(fā)揮了作用。許多研究證實(shí)了化療藥物如阿霉素、順鉑、5-氟尿嘧啶等耐藥的發(fā)生與端粒的長度及端粒酶活性的改變相關(guān)[7-8]。在我們的研究中，目前僅發(fā)現(xiàn)端粒酶基因TERT上的rs33954691位點(diǎn)AG基因型與乳腺癌化療敏感性顯著相關(guān)，并未發(fā)現(xiàn)rs2735940與乳腺癌化療敏感性之間的關(guān)聯(lián)。可能是由于我們選擇的樣本激素水平有一定的偏差，尤其是PR，在臨床資料統(tǒng)計分析中，PR在敏感組和耐藥組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這有可能是造成rs2735940與乳腺癌化療敏感性之間關(guān)聯(lián)不存在的原因。根據(jù)我們的結(jié)果及之前的一些研究推測，端粒酶基因TERT上的rs33954691位點(diǎn)的多態(tài)性可能會影響人群中端粒酶活性發(fā)揮正常功能，進(jìn)而影響了端粒的長度，使端粒長度變長，最終導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。然而這一推測還需通過功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步去驗(yàn)證。

3.3 端粒酶基因TEP1上GCAAG、TTGGC這兩種單體型與乳腺癌患者化療耐藥風(fēng)險相關(guān)

為進(jìn)一步證實(shí)端粒酶基因多態(tài)性與乳腺癌化療敏感性之間的關(guān)聯(lián)，我們對 TEP1基因上的 rs2678685、rs1713449、rs1760897、rs872072、rs938886位點(diǎn)進(jìn)行單體型構(gòu)建及連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)端粒酶基因TEP1上GCAAG、TTGGC這兩種單體型可增加乳腺癌患者化療耐藥風(fēng)險。這一結(jié)果說明端粒酶基因多態(tài)性位點(diǎn)可能與乳腺癌化療耐藥存在相關(guān)性，未來還需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)探究其與乳腺癌耐藥的相關(guān)性。