環狀RNAs 作為宮頸癌潛在生物標志物及治療靶點的研究進展

李賀同，王偉，郝敏

宮頸癌發病率在女性惡性腫瘤中高居第二位，嚴重危害女性健康。近年來，隨著人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的使用和子宮頸癌篩查的普及，宮頸癌發病率在西方發達國家明顯下降，而我國宮頸癌的發病率卻有升高趨勢[1]。然而目前較高的HPV 感染率和較低的宮頸癌發病率加重了篩查的經濟負擔；盡管目前宮頸癌的治療方法包括手術和放化療，這些方法對于晚期或復發宮頸癌的治療效果不佳同時依然不能滿足早發現早預防的需要，宮頸癌早發現早預防仍是重大衛生健康問題。因此尋找宮頸癌前早期預警指標以及潛在治療靶點仍然是需要迫切解決的問題。近年研究證實環狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）在宮頸癌組織中差異性表達，提示其可能在宮頸癌的發生發展中起著重要作用，并有望作為新型腫瘤標志物或分子治療靶點應用于臨床。

1 circRNAs 概況

早在1976 年，Sanger 等[2]首先報道類病毒是單鏈共價閉合的環狀RNA 分子，且以高度配對堿基的棒狀結構存在。隨著轉錄組測序技術（RNA seq）的發展，2012 年circRNA 正式被定義[2-3]。CircRNA 作為剪接過程的產物，以其獨特的結構和不斷發現的生物學功能近年來引起越來越多的關注。CircRNA 在真核細胞中保守且含量豐富，高于同源線性RNA 10倍以上[4]。CircRNA 由基因的外顯子序列反向首尾連接形成，是無游離5′端帽子、3′端poly（A）尾巴的共價閉合環狀結構，這種結構使其比線性RNA 更穩定，不被核酸外切酶降解，半衰期可長達24 h，這些特性使其可能成為潛在的生物標志物。

CircRNAs 通過剪切體、順式作用元件驅動及RNA 結合蛋白（RBPs）調控后環化通過反向剪接形成。依據在剪接過程中雜合形成的序列是否保留部分內含子可以將形成的circRNA 分為4 種類型，即外顯子來源的外顯子型circRNA（ecircRNA）、內含子來源的內含子型circRNA（ciRNA）、內含子和外顯子雜合的外顯子-內含子型circRNA（EIcircRNA）以及由tRNA 前體（pre-tRNA）內含子產生的tRNA 內含子型RNA（tricRNA）。

CircRNAs 的形成受到嚴密調控，并且受轉錄速率影響。有報道，順式作用元件能夠促進circRNAs 的生成。另外，多種RBPs 如FUS 蛋白（fused in sarcoma，FUS）、富含精氨酸/絲氨酸的蛋白質（SR）、核不均一核糖核蛋白（hnRNP）和顫抖蛋白（QKI）等均可調節circRNA 產生。

近年circRNAs 繼微小RNA（miRNAs）和長鏈非編碼RNA（lncRNAs）后成為RNA 領域熱點，由于circRNA 在細胞中的眾多功能，其在腫瘤診斷治療中的作用受到重視。CircRNA 主要發揮miRNA 海綿、與RBPs 結合、調節轉錄以及編碼蛋白四大功能[5]。許多研究已證實，circRNAs 在多種癌癥細胞系中高表達。CircRNAs 豐富且保守，在不同組織和細胞發育階段有特定的功能，同時在血液、唾液及外泌體等部位均可穩定表達。另外，circRNAs 比miRNAs更容易檢測，逆轉錄聚合酶鏈反應和原位雜交比蛋白檢測更具敏感性和特異性[6]。基于上述特點，circRNAs可成為腫瘤的潛在標志物。因此，總結circRNAs 參與宮頸癌發生發展及與復發轉移的關系，有助于開發宮頸癌在轉錄水平的診斷和治療方法。

2 circRNAs 參與腫瘤機制

2.1 circRNA-miRNA 海綿CircRNA 在腫瘤中主要通過競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制發揮miRNA 海綿（miRNA sponge）作用。MiRNA 是一類單鏈非編碼RNA，circRNAs 富含miRNA 反應元件（MREs），通過與靶基因mRNA 的3′非翻譯區（3′-UTR）結合負性調控靶基因表達，發揮miRNA 海綿作用，解除miRNA 對其靶基因的抑制作用，進而升高靶基因的表達水平[7]。此外，circRNAs還可在細胞核內參與轉錄調控，與mRNA 前體發生剪切競爭，甚至可以翻譯表達有效蛋白。

CircMTO1（has_circRNA_0007874）可以抑制miR-9，miR-9 可以抑制p21 從而抑制細胞周期[8]。相反，小腦變性相關蛋白1 翻譯轉錄物（ciRS-7）和circ100290 可以促進細胞周期。CiRS-7 通過抑制miRNA-7 促進下游致癌基因表皮生長因子受體（EGFR）和絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RAF1）表達[9]。CiRS-7 高表達的宮頸癌患者HPV 感染及不良預后的比例更高，同時ciRS-7 在區分宮頸癌患者與健康對照者（AUC=0.972），相比傳統標志物癌胚抗原CEA（AUC=0.885）和糖類抗原CA-125（AUC=0.881）具有更高的效度[10]。

2.2 circRNAs 與RBPs 結合CircRNAs 作為可變剪接產物在不同腫瘤調節基因表達方面有重要功能。許多證據表明circRNAs 可以通過結合像QKI、AGO、POLⅡ和MBL 等多種調節腫瘤基因表達RBPs參與腫瘤調控。例如，QKI 和circRNA 之間的相互作用可以調節腫瘤生長過程中的上皮-間質轉化（EMT）。CircFoxo3 在腫瘤細胞凋亡時顯著升高，通過結合Foxo3 蛋白和p53 蛋白促進MDM2 介導的p53 泛素化降解，促進腫瘤細胞凋亡。此外，circFoxo3還可通過與周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21）和細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）形成三元復合物抑制血管生成和細胞周期[11]。CircRNA 與其同源線性RBP 之間競爭作用進而影響翻譯，人抗原R（HuR）是宮頸癌細胞中表達的RBP，circPABPN1 可以與HuR 結合，競爭性抑制HuR 與PABPN1 mRNA結合進而降低核多聚腺苷酸結合蛋白1（PABPN1）翻譯[12]。

2.3 circRNAs 調控信號傳導通路CircITCH 通過阻斷Wnt/β-catenin 信號通路抑制細胞周期。CircMYLK通過VEGFA/VEGFR2 通路增強促血管生成作用。Circβ-catenin 可通過拮抗糖原合成酶激酶-3（GSK3β）介導的β-連環蛋白（β-catenin）磷酸化激活Wnt 通路參與肝癌發生[13]。CircPPP1R12A（hsa_circ_0000423）可編碼蛋白circPPP1R12A-73aa，circPPP1R12A-73aa可通過激活Hippo-YAP 信號通路促進結直腸癌的發生和轉移[14]。CircAGFG1 通過與miR-370-3p 作用促進絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RAF1）表達，激活RAF/MEK/ERK 信號通路，促進宮頸癌細胞增殖和遷移。同時circAGFG1 水平與腫瘤體積、轉移和分期相關，circAGFG1 表達水平越高，預后越差，即circAGFG1表達水平與預后負相關[15]。

3 circRNAs 在宮頸癌中的作用

3.1 circRNAs 通過miRNA 海綿吸附作用參與宮頸癌發生研究已發現circRNAs 通過多種機制參與宮頸癌的發展，miRNA 海綿是其中最重要的機制，見表1。

表1 circRNAs 作為miRNA 海綿參與宮頸癌發生發展調節軸

3.1.1 circRNAs 與腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結轉移及不良預后 CircRNA 在宮頸癌細胞和組織中高表達，吸附miRNA 進而調節靶基因表達，促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，且與腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結轉移及不良預后呈正相關。體內外實驗說明circNRIP1 通過吸附miR-629-3p 調節PTP4A1/ERK1/2 通路促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移[16]。Has_circ_0001038 通過吸附miR-337-3p 解除對細胞周期素M3（CNNM3）和結腸癌轉移相關基因1（MACC1）的抑制作用，促進宮頸癌細胞生長和侵襲[17]。

Has_circ_0018289 通過miRNA 海綿吸附作用直接結合miRNA-497 促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移作用[18]。一項前瞻性研究表明，circ_0018289 表達與無瘤生存率和總生存期呈負相關，ROC 曲線下面積為0.907（95%CI：0.879～0.935），其對于區分腫瘤組織和鄰近組織有意義[19]。CircRNA8924 通過競爭性結合miR-518d-5p/519-5p 家族間接調節候選基因色素框同源蛋白8（CBX8）的表達進而促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[20]。Circ_0067934 通過吸附miRNA-545 抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和EMT，在活體內circ_0067934 缺失可以抑制腫瘤生長[21]。Circ-MYBL2 通過海綿吸附miR-361-3p 促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和EMT[22]。Circ_0005576 在組織和細胞系中均可高表達且其水平與患者的總生存時間負相關。敲除circ_0005576 可抑制細胞增長、集落形成和轉移。補救分析進一步證實了circ_0005576/miR-153-3p/KIF20A 軸在細胞增殖、遷移和侵襲中的作用[23]。

3.1.2 促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和轉移 Has_circ_101996 可與miR-8075 結合進而上調Xklp2 靶蛋白（TPX2）促進宮頸癌細胞增殖和侵襲[24]。Circ-HIPK3 通過吸附miR-338-3p，上調缺氧誘導因子1α（HIF-1α）表達，介導EMT，最終促進宮頸癌細胞生長和轉移[25]。CircMYLK 吸附miR-1301-3p 促進腦組織內Ras 同族體（RHEB）表達，激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，促進宮頸癌細胞惡性生長[26]。由TGF-β 產生的circ-AKT1 可以吸附miR-942-5p上調蛋白激酶B 抗體（AKT1）表達，同時促進宮頸癌細胞EMT[27]。CircSMARCA5 可通過競爭結合miR-620在宮頸癌組織中下調，過表達時可使腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移并誘導細胞周期停滯[28]。Has_circ_0023404 結合miR-136 后轉錄因子CP2（TFCP2）表達增加，激活下游Yes 相關蛋白（YAP）信號通路促進宮頸癌，敲除可顯著抑制宮頸癌細胞增殖和轉移[29]。Has_circ_0000263 通過結合miRNA-150-5p 調節鼠雙微體基因4（MDM4）表達，最終影響p53 基因表達，敲除可抑制癌細胞增殖和侵襲。因此，has_circ_0000263/miRNA-150-5p/MDM4/p53 調節軸參與宮頸癌發生發展[30]。Has_circ_000284 通過吸附miRNA-506 促進鋅指蛋白2（Snail-2）表達，敲除可抑制細胞增殖和侵襲同時使細胞周期停滯在G0/G1 期，促進宮頸癌細胞增殖和侵襲，沉默has_circ_000284 有助于宮頸癌治療[31]。Circ-ATP8A2 吸附miRNA-433 在轉錄后水平抑制EGFR 表達，促進宮頸癌進展[32]。CircEIF4G2 可通過吸附miR218 增加同源異形盒基因A1（HOXA1）表達水平，補救實驗證明轉染miR218抑制劑后減弱了circEIF4G2 對miR218 抑制作用，降低了細胞的增殖、遷移和侵襲作用。相反，沉默HOXA1 可以逆轉miR218 抑制劑在宮頸癌細胞的影響[33]。Circ_0004214 是血管抑素結合蛋白樣蛋白1（AMOTL1）的環狀產物，通過實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析，circAMOTL1 在宮頸癌組織中上調，尤其是在有遠處轉移的腫瘤組織中明顯上調，通過吸附miR-485-5p 促進AMOTL1 表達[34]。低分化癌和淋巴結轉移患者has_circ_0000745 高表達，敲除后通過上調E-鈣黏蛋白（E-cad）抑制細胞增殖、遷移和侵襲[35]。CircSLC26A4 在宮頸癌細胞和組織中高表達與生存率相關；通過吸附miR-1287-5p 作用于HOXA7 mRNA 3′UTR，促進宮頸癌細胞增殖。另外，RBP 在SLC26A4 內含子處與QKI 反應元件結合促進circSLC26A4 生成。CircSLC26A4 通過QKI/circSLC26A4/miR-1287-5p/HOXA7 軸促進宮頸癌的發生[36]。

這些發現清晰地展示了circRNAs 在宮頸癌細胞或組織中上調，主要通過circRNA-miRNA-靶基因調節軸參與宮頸癌發生發展，提示circRNA 靶點成為宮頸癌診斷和治療標志物的潛在可能。

3.2 circRNAs 通過與HPV 作用參與宮頸癌前病變CircRNAs 可以調節參與天然免疫的基因，為病毒感染提供保護作用。細胞免疫因子是circRNA 生成過程的重要調節因子，能夠抑制病毒感染[37]。從流行病學和分子角度，持續性HPV 感染是宮頸癌的主要病因。HPV16 編碼的E6、E7 蛋白參與宮頸上皮細胞的轉化，導致宮頸癌發生發展。HPV16 E7 通過調節circRNA 表達參與宮頸癌發生發展。通過siRNA干擾下調宮頸癌HPV 16 陽性細胞系Caski E7 的表達，獲得宮頸癌細胞circRNA 表達譜：發現352 個上調和174 個下調circRNA，京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示上調circRNA 主要參與mTOR 信號通路、脂肪酸代謝等通路；下調circRNA主要參與精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、癌癥中的中樞碳代謝等通路[38]。CircE7 由HPV16 E7 產生，mA6 修飾，通過與核糖體結合作用，翻譯產生E7癌蛋白。在通過逆轉錄PCR 和HPV16 轉染的細胞免疫印跡（northern blotting）均可證實circE7 的存在，在Caski 細胞中敲除circE7 后，E7 蛋白水平降低，癌細胞生長受抑制[39]。由于HPV 在轉錄后要發揮調節作用來適應不同分化程度的上皮細胞，circRNA 的生成可以影響HPV 的感染免疫逃逸。該研究為circE7 進一步在宮頸癌中的診斷及治療作用提供了依據。雖然與HPV16 E7 癌蛋白相關的circRNA 研究少有報道，但已有研究證明HPV 參與了circRNA 的表達譜改變。從circRNA 的角度研究HPV E7 癌蛋白對HPV 感染后宮頸癌前病變的影響將為尋找新的潛在生物標志物提供新思路。

4 circRNAs 的臨床應用前景

作為非常有前景的無創生物標志物，目前研究已證實多種circRNAs 在宮頸癌細胞中差異表達，其參與宮頸癌的主要機制是競爭結合miRNA，發揮海綿吸附作用，參與腫瘤生長、侵襲、遷移和轉移等。目前對于circRNAs 在宮頸癌中的研究尚處于起步階段，其詳細分子作用機制尚未完全闡明。

由于circRNAs 的多樣性與宮頸癌轉移、預后等相關，circRNAs 可以是治療靶點，也可以成為治療載體。對于促進宮頸癌發展的circRNAs，可以利用與反向剪接部位完全互補配對的siRNAs 抑制circRNAs表達或者在mRNA 前體階段通過互補反義寡核苷酸干擾反向剪接過程，同時避免干擾同源線性mRNA 表達；而對于抑制宮頸癌生長的circRNAs，可采取基因療法或人工合成誘導表達。由于circRNAs具有高度穩定性和吸附miRNA 的特點，可借助其特異的結合位點作為運輸載體結合致癌性miRNA 和蛋白質抑制腫瘤生長和誘導凋亡。從精準醫學角度治療，可通過設計細胞特異性啟動子，限定circRNAs在不同類型不同階段細胞的時空表達；或者根據調節靶點設計circRNAs 與miRNA、蛋白的結合位點作用于特定的致癌因子。另外，circRNAs 可能作為蛋白翻譯的模板，可設計表達腫瘤抑制蛋白的circRNAs，進一步將circRNAs 轉化為有效治療腫瘤的手段。

在檢測方面，有研究將宮頸癌患者術前血漿circRNA 水平與腫瘤切除術后水平對比，發現很多在血漿中升高的circRNA 在術后仍然高表達，還有一些circRNA 在術后降低；最終發現74 種circRNAs基因在術前和術后間表現出顯著臨床差異，circRNA微陣列已經被證實有效，且其檢測效率高于RNAseq 技術[40]。目前，對于circRNA 的特性及檢測技術已有較深入的研究，一種circRNA 可以有多個miRNA 靶點，參與多種功能，但究竟選取哪些特異度、敏感度高的circRNAs 可作為診斷標志物仍需更進一步的探索。一項生物信息分析納入了7 個在宮頸癌和正常組織中差異表達的circRNAs，通過建立circRNA-miRNA-mRNA 調節網絡、蛋白互作網絡（PPI）及功能富集分析，最后發現hsa_circ_0084927最有價值成為宮頸癌標志物[41]。

目前沒有足夠精確的檢測方法用于監測宮頸癌的發生發展，circRNA 在腫瘤中穩定存在、豐富、保守及可在宮頸癌細胞中差異表達的特點有助于為早期診斷、治療提供新的方向，并可能成為非侵入性診斷、治療方案，但在這些circRNAs 作為診斷和治療標志物應用于臨床前仍需進一步證實。