人臍帶間充質干細胞促進宮腔粘連大鼠子宮內膜增殖與分化

汪沙，郭正晨，湯一群，段華

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）是指經由反復機械創傷或感染破壞子宮內膜基底層后內膜修復障礙，引起宮腔內纖維組織增生，導致宮腔部分或全部粘連閉塞的常見婦科疾病，主要引起月經異常、周期性腹痛、不孕及反復流產等，是導致子宮性不孕癥的最常見原因，約25%～30%的不孕癥婦女患有IUA[1]。經宮腔鏡宮腔粘連分離術（transcervical resection of adhesion，TCRA）是目前IUA 的經典治療方法，雖然術后輔以人工周期、放置宮內節育器、羊膜及球囊等措施預防再次粘連[2-5]，但未能有效恢復子宮內膜組織結構和生理功能，無法重建不孕女性生育能力。干細胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細胞，尤其是存在于多種器官組織中的間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），可在體外培養增殖，能夠在特定條件下分化成各類細胞。其中人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC）存在于新生兒臍帶華通膠，與其他MSC 相比，具有獲取簡便，來源豐富，易于分離培養，病毒感染風險低，免疫原性低，含有較長的端粒酶，無因外界因素引起的DNA 損傷等諸多優勢[6]，多向增殖分化潛能、組織損傷修復、免疫調節性能優越[7]，是細胞移植治療領域最具前景的MSC 之一。目前，已有大量研究將其應用于治療肝腎纖維化、心腦血管疾病、器官缺血再灌注損傷等諸多領域[8-11]。然而，目前尚無hUCMSC 應用于子宮內膜再生障礙性疾病如宮腔粘連等領域的相關研究報道。故本實驗通過建立IUA 大鼠模型，將hUCMSC移植至IUA 大鼠子宮中，觀察hUCMSC 能否在體內存活并發揮作用，初步探索其對損傷子宮內膜增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 人臍帶標本 健康足月剖宮產新生兒臍帶組織，產婦無傳染病等其他合并癥。于首都醫科大學附屬北京婦產醫院產科手術室收取長約10 cm 臍帶組織。將新鮮標本置于含青-鏈霉素及滅菌生理鹽水的標本盒中，干冰降溫保存，2 h內帶回實驗室處理。標本取材經醫院倫理委員會批準，供者及家屬知情同意。

1.1.2 實驗動物 成年雌性SD 大鼠20 只（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供），SPF 級，年齡9～11 周，體質量200～250 g。飼養于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，4～5 只大鼠為一籠，空氣流通，無噪音，12 h 明暗光交替照射，室溫（22±2）℃，相對濕度（55±2）%，自由進食和飲水，適應性飼養1 周。實驗動物許可證號：SCKK（京）2012-0001，相關動物實驗操作及手術方案經由首都醫科大學倫理委員會批準通過。

1.1.3 主要試劑和儀器 Anti-Ki-67 antibody[SP6]:ab16667（英國Abcam 公司），Pan-Cytokeratin(H-240):sc-15367（美國Santa Cruz 公司）FITC，標記山羊抗兔熒光二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）、羅丹明標記山羊抗小鼠熒光二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），流式抗體（CD29、CD34、CD90、CD73、CD105、HLA-DR，BD 公司美國），ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），流式細胞分析儀（美國Beckman公司），倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 大鼠麻醉成功后，取下腹正中恥骨聯合上沿腹白線做2～3 cm 切口，逐層分離進入腹腔，充分暴露子宮。沿左側（造模側）子宮上端作3 mm 橫切口，使用直徑2 mm 的眼科刮匙全面搔刮整個宮腔，直至出現宮壁粗糙感，并伴有刮匙進入子宮凹凸感消失則可停止刮宮，生理鹽水沖洗宮腔，防止內膜殘存，6-0 可吸收線縫合子宮切口；右側（未造模側）子宮作為自身對照，不作造模處理。關腹后放入籠內繼續飼養。

1.2.2 hUCMSC 分離、培養和鑒定 將采集的臍帶標本剪成1 cm 左右的臍帶段后，仔細剔除臍帶外膜及臍動靜脈，獲取華通膠組織,將其充分剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 大小。采用組織貼壁法[12]進行hUCMSC 原代培養后傳代培養。使用流式細胞儀檢測hUCMSC P3 細胞表面CD73、HLA-DR、CD29、CD90、CD34 和CD105 的表達。

1.2.3 實驗動物分組及干預 造模后14 d，將20 只造模大鼠隨機分為干細胞組和對照組2 組，每組10 只。大鼠麻醉后同造模方法作腹部切口充分暴露子宮。干細胞組于造模側子宮肌壁間多點注射hUCMSC 懸液0.5 mL（1×107/mL），對照組于造模側子宮肌壁間注射磷酸鹽緩沖液（PBS）0.5 mL，關腹后放入籠內繼續飼養。干預后7 d 處死，收集2 組造模側子宮組織，肉眼觀察子宮大體形態，沿縱軸切開子宮并觀察宮腔形態，隨后平均分為2 份，分別置于4%中性甲醛固定液中用于切片染色，或凍存于-80 ℃冰箱，以備提取組織RNA。

1.2.4 hUCMSC 在大鼠子宮中的定植和分化檢測 采用hUCMSC 標記物人核（Human Nuclei，HuNu）抗體對干細胞組和對照組造模側新鮮子宮組織進行免疫熒光染色，觀察HuNu 的定性表達及分布情況。熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光（HuNu），即為hUCMSC 在大鼠子宮組織中定植。采用HuNu抗體與子宮內膜上皮細胞標記物角蛋白（CK）抗體或子宮內膜間質細胞標記物波形蛋白（VIM）抗體共同行免疫熒光染色，觀察共表達情況。

熒光顯微鏡下觀察CK 及VIM 均呈現綠色熒光。若在HuNu 與CK 共染切片中，觀察到紅色熒光與綠色熒光共同表達于同一細胞，表明hUCMSC 分化為子宮內膜上皮細胞；若在HuNu 與VIM 共染切片中，觀察到紅色熒光與綠色熒光共同表達于同一細胞，表明hUCMSC 分化為子宮內膜間質細胞。

1.2.5 增殖相關細胞因子在大鼠子宮中的表達檢測 對增殖細胞核抗原Ki-67 和CK 的單克隆抗體進行免疫組化染色，CK 的陽性表達位于上皮細胞胞質中，呈現棕黃色顆粒，Ki-67 陽性表達為細胞核呈深棕色。每張免疫組化染色切片隨機選取4 個200 倍視野，通過Image pro plus 軟件進行圖像分析計算，取平均值作為平均光密度，觀察Ki-67 及CK 的蛋白表達情況。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測子宮組織中Ki-67 和CK 的mRNA 的表達水平（逆轉錄反應體系和引物見表1、2）。采用2-ΔΔCT相對定量法，計算目的基因mRNA 相對表達量，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。每個樣品重復3 次，取三者平均值。

表1 20 μL 逆轉錄反應體系

表2 引物序列

1.3 統計學方法采用GraphPad Prism 7.0 軟件以及SPSS 22.0 軟件進行統計分析。定量資料以均數±標準差（）表示，所有數據均進行正態性檢驗，服從正態分布的數據組間比較采用獨立樣本t 檢驗；不服從正態分布的數據采用秩和檢驗進行比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IUA 大鼠模型的子宮內膜組織學表現及宮腔剖視圖子宮內膜組織在IUA 大鼠造模側子宮及未造模側子宮內膜組織有明顯的表現差異：未造模側子宮內膜結構清晰，可見腺上皮及腔上皮細胞呈單層柱狀排列，緊密連續，腺體數量多，分布均勻，間質細胞數量正常，排列有序（圖1A、C）；而對照組造模側子宮腔縮窄，內膜腺體稀疏，結構紊亂，皺褶減少，腔上皮缺失，間質細胞減少，排列紊亂，間質內無細胞結構區域增多（圖1B、D）；此外、IUA 大鼠未造模側子宮宮腔剖視圖可見形態規則，粗細均勻，顏色淡紅，光滑有彈性，血供豐富，剖視宮腔，見宮腔通暢，內膜較厚，平整光滑，顏色淡紅（圖1E）；而造模側子宮宮腔剖視圖明顯表現為子宮形態欠規則，粗細不等，顏色蒼白，僵直彈性差，質地較硬，沿縱軸剖開宮腔，見粘連帶形成，宮腔欠通暢，部分閉塞，內膜變薄缺失，僵硬色白，表面凹凸不平（圖1F）。

圖1 IUA 大鼠模型的宮腔剖視圖及子宮內膜組織學表現

2.2 hUCMSC 體外培養形態和鑒定采用組織貼壁法體外培養hUCMSC，第7 天可見組織塊周圍有細胞爬出，第14 天細胞已成片聚集。細胞形態呈典型長梭形，成纖維細胞樣貼壁生長，平行排列或漩渦狀生長，形態相對均一，核仁清晰（圖2A）。傳代后的細胞生長迅速，貼壁較快，3～5 d 左右可再次傳代。凍存后復蘇的細胞形態與生長狀態與未凍存無明顯差異。通過傳代培養，P3 細胞CD73、CD90、CD105 和CD29 的表達陽性率均＞95%，而HLA-DR 以及造血干細胞表面標記CD34 表達陽性率＜5%（圖2B～H）。

圖2 hUCMSC 體外培養形態和鑒定結果

2.3 hUCMSC 在大鼠子宮中的定植移植后1 周，干細胞組可見少量紅色熒光（圖3A），對照組未見紅色熒光表達（圖3B）。干細胞組中，紅色熒光主要分布在靠近宮腔的子宮內膜組織中，子宮肌層內未見紅色熒光。

2.4 hUCMSC 在大鼠子宮中的分化干細胞組中，在HuNu 與VIM 共同染色切片中，發現紅色熒光與綠色熒光共同顯影于同一細胞（圖3C），而在HuNu 與CK 共同染色切片中，發現紅色熒光與綠色熒光不存在共顯于同一細胞的現象（圖3D）。

圖3 大鼠子宮組織免疫熒光染色

2.5 增殖相關細胞因子在大鼠子宮中的表達情況干細胞組的Ki-67 和CK 平均光密度和mRNA 表達均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

IUA 是婦科常見病，其引起的月經異常、周期性下腹痛及繼發不孕等嚴重影響育齡期女性的健康，其中中重度IUA 即使行TCRA 恢復宮腔形態后，術后妊娠率仍不滿意，特別是IUA 復發的患者妊娠率更低，僅為7.1%[13]。有學者通過臨床病例對照研究發現，子宮動脈栓塞術后IUA 患者行IUA 分離術后生殖預后差，其原因可能與子宮動脈栓塞術后子宮血管灌注不良影響術后內膜再生有關[14]。因此，促進子宮內膜再生，修復受損子宮內膜是改善IUA 患者癥狀，尤其是重建IUA 患者生育功能的基礎，是提高IUA 療效的重中之重。

3.1 IUA 大鼠模型的建立受倫理學的限制，對IUA 的研究需要建立穩定的動物模型。目前，國內外關于成功建立IUA 動物模型的文獻相對較少，造模方法主要以物理性、化學性或雙重損傷為主，而通過理化損傷建立的模型并不適合模擬人類IUA 的研究。本研究表明，采用機械損傷法可成功建立大鼠IUA 模型，此模型可用于IUA 發病機制的不同研究，并為本研究進一步探索hUCMSCs 在有機體中的移植途徑和對受損子宮內膜的影響奠定基礎。

3.2 hUCMSC 的培養和鑒定本研究應用組織貼壁法成功建立了hUCMSC 細胞系，并總結出以下經驗：臍帶組織要充分剪碎，均勻平鋪于皿底，培養最初的12 h，可將皿倒扣于培養箱，以減少細胞與皿底的黏附性，有利于細胞爬出，12 h 后應少量加入培養液，以免使組織塊漂浮，放置培養箱后盡量減少翻動。培養7 d 可見細胞爬出，14 d 細胞大量貼壁，倒置光鏡下可觀察到從初始貼壁到傳代后的典型MSC，細胞形態均一，呈紡錘梭形、成纖維細胞樣貼壁生長。組織貼壁法簡單可靠，分離出的細胞純度較高，傳代后細胞形態及增殖活性穩定。流式細胞儀檢測傳代至第三代的細胞發現，這些細胞高表達MSC標志物CD29、CD73、CD90 和CD105，不表達造血干細胞標記物CD34 以及HLA-DR。培養的細胞在細胞形態及免疫表型方面均符合hUCMSC 特征[15]。

3.3 hUCMSCs 的示蹤及定植本研究將人來源的UCMSCs 移植入大鼠體內，屬于異種異體移植，移植后直接采用HuNu 抗體染色，既可省去干細胞標記過程，亦可簡單、高效地追蹤到大鼠體內的移植細胞。本研究觀察到紅色熒光染色的hUCMSC 可在大鼠受損子宮內膜存活并主要分布在靠近宮腔的子宮內膜組織中，并且在實驗期間經干細胞移植治療的大鼠均無明顯的急慢性的免疫排斥反應發生。這可能得益于hUCMSC 低免疫原性的特點[16]。本研究雖采用人鼠異種移植方式，但由于hUCMSC 缺失能夠啟動并誘導免疫應答的HLA-DR 表面標記，因此異種移植存在天然免疫耐受。hUCMSC 這種天然免疫耐受的特性也為臨床干細胞異體移植提供了可能性。

3.4 hUCMSC 的移植途徑干細胞移植方式多種多樣，靜脈移植最常見，然而干細胞經血液循環必將損失一部分，尤其是經肺循環的首過效應，將損失一大部分細胞。有研究顯示炎癥趨化因子CXCL12 可趨化干細胞遷移并定植于損傷部位[17]。此外，接受手術的大鼠正處于急性炎癥期，腹部切口及子宮內膜損傷部位大量的炎癥介質釋放入血，若此時將干細胞注射至血液循環中，干細胞受到促炎因子的趨化，一部分遷移至腹部創口，則遷移至子宮內膜損傷部位的干細胞數量便會減少。因此本研究采用原位移植的方法，以期在損傷部位維持一定的細胞濃度，盡可能多地將hUCMSC 保留在子宮內膜損傷部位。本研究結果顯示，當大鼠腹部創口基本愈合后，移植側子宮通過免疫熒光染色仍可檢測到hUCMSC 定植并存活于子宮內膜中，并發現細胞增殖能力較對照組顯著提升，表明hUCMSC 在IUA 大鼠體內原位移植發揮了一定作用。

3.5 hUCMSC 對受損子宮內膜的影響本研究通過檢測上皮細胞標記物CK，發現無論在蛋白或基因水平，干細胞組的表達明顯升高。Ki-67 作為反應細胞增殖活躍程度的指標，在干細胞組的表達顯著上升。然而這種通過補充外源性的干細胞促進受損內膜再生修復的機制目前仍不清楚，可能有三種機制：①外源性干細胞分化為具有相應功能的內膜細胞，從而替代了原本的內膜干細胞；②外源性干細胞通過分泌有益于組織修復的細胞因子促進了殘留子宮內膜細胞增殖分化；③外源性干細胞趨化自身骨髓MSC，進而促進子宮內膜修復。本研究通過觀察hUCMSC標記物HuNu 與CK 的共染色情況，發現二者并不存在共表達于同一細胞的現象，說明hUCMSC 并未分化為子宮內膜上皮細胞。在HuNu 與間質細胞標記物VIM 的共染色切片中，本研究發現HuNu 陽性的細胞VIM 均呈陽性表達，提示hUCMSC 有分化為內膜間質細胞的可能。然而，由于子宮內膜間質細胞缺乏特異性標記物，hUCMSC 作為一種MSC 本身就可表達VIM，無法確切證明hUCMSC 是否分化為子宮內膜間質細胞。目前尚無研究表明hUCMSC 可在體內分化為子宮內膜細胞的相關文獻。本研究對干細胞的在體分化機制進行了初步探索，未得到hUCMSC分化為子宮內膜細胞的證據，分析原因可能是由于定植于損傷處的干細胞數量有限，觀察時間較短；體內環境復雜多變，影響因素眾多，能發揮替代功能的干細胞分化效率低下；不同組織或器官中干細胞的分化機制有差異。總之，hUCMSC 在體分化機制仍需進一步探索。因此，本研究認為hUCMSC 很可能是通過旁分泌多種細胞因子促進了自身內膜組織的增殖修復，具體機制還需進一步實驗證實。

綜上所述，hUCMSC 不僅具有MSC 的一般特征，還具有獨特的自身優勢，使其在細胞治療異體移植領域前景廣闊，本實驗將hUCMSC 應用于修復IUA大鼠受損子宮內膜，觀察到hUCMSC 可在損傷部位存活并定植，并初步探索了hUCMSC 對子宮內膜增殖分化的影響，發現hUCMSC 可能并非經分化為子宮內膜細胞起作用，而是通過上調Ki-67 和CK 的表達改善組織修復微環境。