自噬在多氯聯(lián)苯118致大鼠甲狀腺組織損傷中的作用機(jī)制

王莉，許文立，朱曉霞，段宇

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029

近年，隨著工業(yè)化進(jìn)程不斷推進(jìn)，環(huán)境污染對(duì)人類健康已造成嚴(yán)重威脅。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（EEDs）是一類外源性化學(xué)物質(zhì)，能夠干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)天然激素合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)人體生長/發(fā)育、神經(jīng)、生殖及免疫系統(tǒng)等多臟器/多系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響［1］。多氯聯(lián)苯（PCBs）為EEDs的一種，因曾廣泛應(yīng)用于電池、農(nóng)藥、塑化劑、建筑材料等的原料，在環(huán)境中普遍存在。PCBs具有垂直傳播、持久富集等特性，可通過食物鏈蓄積長期存在于動(dòng)物和人體內(nèi)，又被稱為典型的“持續(xù)性有機(jī)污染物（POPs）”。環(huán)境中PCBs殘留能對(duì)人體神經(jīng)、免疫、心血管、生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴(yán)重危害［2-3］。在長三角地區(qū)，PCB118作為PCBs最具代表性的成員之一，常被用于衡量環(huán)境中總PCBs的重要指標(biāo)［4］。

研究表明，PCBs可通過多種機(jī)制干擾下丘腦—垂體—甲狀腺軸，進(jìn)一步損害甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能［5-6］。課題組前期體內(nèi)及體外研究顯示，PCB118可造成甲狀腺超微結(jié)構(gòu)破環(huán)和自噬現(xiàn)象產(chǎn)生［7］。然而，潛在的觸發(fā)機(jī)制尚不清楚。Tubb3作為β-微管蛋白（β-tubulin）家族的重要成員，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。另有研究表明，諾考達(dá)唑能誘導(dǎo)Tubulin與DAPK2-C端氨基酸結(jié)合并相互作用，由此激活DAPK2及其后續(xù)細(xì)胞自噬機(jī)制［9］。2018年9月—2020年6月，我們觀察了PCB118作用后大鼠甲狀腺組織的超微結(jié)構(gòu)，檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白，并從Tubb3/DAPK2-自噬相關(guān)通路的角度探討其可能的分子機(jī)制，為進(jìn)一步揭示PCB118造成甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑及儀器40只雄性Wistar大鼠（6～8周齡，體質(zhì)量280～300 g）購于北京Vital River公司，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。動(dòng)物均置于光照控制（12 h：12 h，明/暗周期交替）和溫度恒定（22±1）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，可自由攝取食物及飲水。PCB118（純度100%；No.31508-00-6）（美國Ac‐cuStandard公司）。一抗包括GAPDH（2118S）、LC3（12741S）、BECLIN1（3495S）、P62（5114S）、Tubb3（5568S）、MRLC（8505S）、phospho-MRLC（p-MRLC，3671S）、ATG9A（13509S）抗體（美國CST公司）；DAPK2（NB100-56344）（美國Novus公司，均為兔抗）；二抗（Vector Laboratories，美國）；PCR引物（上海英俊公司）。總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix Kit、qRT-PCR試劑盒SYBR-Green kit（TaKaRa，日本）、全蛋白提取試劑盒（KGP250/KGP2100）（江蘇凱基生物公司）。StepOnePlus實(shí)時(shí)定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）、超薄切片儀（德國，Leica公司）、透射電子顯微鏡（美國，F(xiàn)EI Company）、組織勻漿儀（德國，IKA公司）、多功能酶標(biāo)儀（美國，MJ Re‐search）、Real-time PCR儀（美 國，Applied Biosys‐tems）、蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及凝膠成像儀（美國，Bio-Rad公司）。

1.2 Wistar大鼠分組及PCB118腹腔注射40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組，分別為A、B、C、D組，予以每組大鼠腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量0、10、100、1 000 μg/（kg·d）PCB118，注射頻率為每周5次，共計(jì)13周。然后所有動(dòng)物被處以安樂死，并分離甲狀腺組織，將甲狀腺組織固定于4%多聚甲醛或直接-80℃保存。

1.3 大鼠甲狀腺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察選取甲狀腺組織，切成0.5～1 mm3的小塊，浸入2.5%戊二醛進(jìn)行前固定，后依次用1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗、1%鋨酸后固定樣品、PBS漂洗、丙酮梯度室溫脫水，然后挑出包埋劑滲透好的甲狀腺組織標(biāo)本進(jìn)行超薄切片、檸檬酸及鉛醋酸鈾雙重染色，最后置于透射電鏡下觀察并攝片記錄結(jié)果。

1.4 甲狀腺組織自噬相關(guān)蛋白及Tubb3/DAPK2-通路蛋白的檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法。取出凍存于–80℃的甲狀腺組織樣本，每個(gè)樣本用分析天平稱取100 mg組織小塊，采用全蛋白提取試劑盒抽提組織總蛋白，用BCA法測(cè)樣品蛋白濃度，后加入對(duì)應(yīng)體積5×loading buffer上樣緩沖液。SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，二抗室溫孵育1 h，再次用TBST洗滌10 min×3次，最后ECM曝光顯影。用Image-J軟件（National In‐stitute of Health，美國）對(duì)蛋白條帶做定量分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量通過目標(biāo)蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.5 甲狀腺組織Tubb3/DAPK2-通路相關(guān)基因的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法。從大鼠甲狀腺組織提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，最后通過SYBR-Green試劑盒在StepOnePlus系統(tǒng)上實(shí)時(shí)定量PCR。引物序列：β-ac‐tin上 游5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′，下 游5′-ATGCAGGGAT-GATGTTCTGG-3′；Tubb3上游5′-GTGACGAGCATGGCATAGAC-3′，下游5′-GGCCT‐GAATAGGTGTCCAAA-3′；DAPK2上游5′-CTTCCT‐GGGAGACACAAAGC-3′，下 游5′-GCTTCCGAAT‐GAAGTCCTTG-3′；NMMHC-ⅡA上游5′-ATCCTTT‐GCACGGGTGAGT-3′，下游5′-CAACGATGTAGCC‐GTTGACA-3′；ATG9A上 游5′-CTAGGGCTTCGA‐CATTGCAT-3′，下游5′-TTCCCGTTCAAATTCCCTTC-3′。以β-actin作內(nèi)參，目的基因表達(dá)量通過2-ΔΔCT法計(jì)算得出。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用-x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Sidak法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組超微結(jié)構(gòu)的變化A組甲狀腺組織細(xì)胞核及濾泡腔結(jié)構(gòu)完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器清晰可見（圖1a）。與A組比較，B、C、D組（圖1b～d）甲狀腺濾泡細(xì)胞損傷、部分空泡化，線粒體密度下降、嵴膜消失，伴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，且上述改變?cè)贑組最為明顯。B組未見典型自噬小體（圖1b），而C組自噬小體數(shù)量明顯增加（圖1c），D組自噬小體數(shù)量顯著增加（圖1d）。

圖1 各組甲狀腺組織超微結(jié)構(gòu)

2.2 各組甲狀腺組織自噬相關(guān)蛋白LC3、BE‐CLIN1、P62水平的比較與A組比較，B組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高（P均＜0.05）；C、D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BE‐CLIN1蛋白表達(dá)升高，P62蛋白表達(dá)降低（P均＜0.01）。與B組比較，C組BECLIN1蛋白表達(dá)升高（P均＜0.01）；D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表達(dá)升高，P62蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。與C組比較，D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表達(dá)升高（P均＜0.01）。各組甲狀腺組織自噬相關(guān)蛋白LC3、BE‐CLIN1、P62水平見表1。

2.3 各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平比較與A組比較，C、D組Tubb3蛋白表達(dá)降低（P均＜0.01），DAPK2蛋白表達(dá)、p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。與B組比較，C組Tubb3蛋白表達(dá)降低，DAPK2蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）；D組Tubb3蛋 白 表 達(dá) 降 低，DAPK2、MRLC、p-MRLC蛋 白 表 達(dá) 及p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。與C組比較，D組DAPK2蛋白表達(dá)降低，MRLC、p-MRLC蛋白表達(dá)及p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平見表2。

表1 各組甲狀腺組織自噬相關(guān)蛋白LC3、BECLIN1、P62水平（-x±s）

表2 各組大鼠甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平（-x±s）

2.4 各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA比較與A組比較，B組Tubb3 mRNA降低，DAPK2、ATG9A mRNA升高（P均＜0.05）；C組Tubb3 mRNA降低，DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9 A mRNA升高（P均＜0.05）；D組Tubb3表達(dá)降低，NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA升高（P均＜0.05）。與B組 比 較，C組DAPK2、ATG9A mRNA升 高（P均＜0.01）。與C組比較，D組DAPK2、ATG9A mRNA降低（P均＜0.05）。各 組 甲 狀腺 組 織Tubb3、DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA水平見表3。

表3 各組甲狀腺組織Tubb3 DAPK2，NMMHC-ⅡA，ATG9A mRNA水平（-x±s）

3 討論

在持續(xù)性環(huán)境有機(jī)污染物中，PCBs因其毒性效應(yīng)而被廣泛研究。PCBs可造成機(jī)體多系統(tǒng)、多組織、多器官損害［9-10］，其中甲狀腺是PCBs作用于內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要靶器官［11］。相關(guān)研究表明，PCBs可影響甲狀腺激素合成、分泌、運(yùn)輸、代謝等方面，造成甲狀腺功能障礙［12］。PCB118作為PCBs具有代表性的成員之一，已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于長江三角洲地區(qū)的水生生物體內(nèi)，甚至蓄積在人體的乳汁及組織中［13-14］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性低劑量PCB118可造成大鼠甲狀腺組織增生肥大、炎癥浸潤及間質(zhì)纖維化［6］，但目前關(guān)于PCB118暴露是否影響甲狀腺超微結(jié)構(gòu)尚不明確。

我們通過透射電子顯微鏡觀察到甲狀腺超微結(jié)構(gòu)毀損，出現(xiàn)線粒體腫脹、濾泡細(xì)胞擴(kuò)張伴部分空泡化；還發(fā)現(xiàn)溶酶體增多、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等亞結(jié)構(gòu)改變，上述變化與ZHOU等［7］研究結(jié)果一致。此外，本研究在暴露于100 μg/（kg·d）及1 000 μg/（kg·d）PCB118劑量的甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，即隨PCB118濃度升高自噬反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，表明低濃度PCB118可誘導(dǎo)大鼠甲狀腺發(fā)生自噬反應(yīng)，且甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷與細(xì)胞自噬可能存在密切關(guān)系，但精確機(jī)制尚不完全清晰。

自噬是一種保守的降解代謝/循環(huán)過程，在維持細(xì)胞自我更新及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用［15］。細(xì)胞自噬可通過多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)介導(dǎo)，從而促進(jìn)膜內(nèi)陷和自噬囊泡的形成［16］。在自噬效應(yīng)的發(fā)生過程中，存在3種與自噬密切相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，分別為與自噬效應(yīng)呈正相關(guān)的LC3及BECLIN1和負(fù)相關(guān)的P62。其中LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化反映了自噬發(fā)生的活性；BECLIN1通過與VPS34相互作用，主要參與調(diào)控自噬體的形成與成熟［17-18］。在本研究中，PCB118暴露組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與BE‐CLIN1蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加效應(yīng)，在PCB118最大劑量［1 000μg/（kg·d）］時(shí)，大鼠甲狀腺組織自噬現(xiàn)象最明顯。另外，作為一種多功能蛋白，P62通過多泛素化蛋白參與自噬機(jī)制，由此調(diào)節(jié)自噬流和自噬溶酶體活性，P62蛋白降解即反映自噬體與溶酶體的融合降解，被用作最終決定自噬效應(yīng)完成的有效標(biāo)志蛋白［19］。本研究結(jié)果顯示，P62蛋白表達(dá)水平隨PCB118劑量升高呈劑量依賴性減少趨勢(shì)，在PCB118劑量為1 000μg/（kg·d）時(shí)達(dá)到最低表達(dá)量。這些結(jié)果表明PCB118以劑量依賴性方式誘導(dǎo)大鼠甲狀腺自噬現(xiàn)象發(fā)生。

Tubb3作為β-tubulin家族的重要成員，受細(xì)胞內(nèi)外多種因素調(diào)節(jié)，其表達(dá)異常可引起組織或細(xì)胞形態(tài)改變，誘發(fā)細(xì)胞解體甚至死亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCB118暴露使得甲狀腺組織Tubb3基因及蛋白表達(dá)下調(diào)，表明PCB118能夠引起微管蛋白改變，進(jìn)而可能損傷到細(xì)胞骨架系統(tǒng)，上述結(jié)果與WANG等［21］的研究相一致。亦有研究證實(shí)，Stathmi、秋水仙堿等抗微管蛋白因子可通過修飾微管蛋白二聚體，干擾其家族基因和蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致微管動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞骨架及結(jié)構(gòu)改變［22-23］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)微管蛋白Tubb3的改變與PCB118引起的甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷具有一致性，提示Tubb3異常表達(dá)可能在PCB118誘導(dǎo)甲狀腺自噬過程中發(fā)揮重要作用。

DAPK2屬于絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶家族成員，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各類細(xì)胞活動(dòng)，如炎癥、凋亡、自噬及質(zhì)膜起泡等［24］。近年來，DAPK2被認(rèn)為是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，其定位于自噬囊泡內(nèi)膜，參與構(gòu)成自噬小體［25］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PCB118能夠促進(jìn)大鼠甲狀腺組織DAPK2基因及蛋白表達(dá)上調(diào)。本課題組前期采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tubb3位于DAPK2上游，其可與DAPK2相互結(jié)合，由此激活DAPK2及其后續(xù)細(xì)胞自噬機(jī)制［7］。由此推測(cè)，慢性低濃度PCB118可能誘導(dǎo)Tubb3表達(dá)異常，進(jìn)一步結(jié)合并激活DAPK2，促進(jìn)后續(xù)自噬反應(yīng)發(fā)生。

已有研究證實(shí)，MRLC是DAPK2的重要底物之一［24］。非肌肉肌球蛋白Ⅱ（以下簡稱“肌球蛋白Ⅱ”）是一種以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的運(yùn)動(dòng)蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)肌球蛋白重鏈（NMMHC-Ⅱ）、兩個(gè)必需輕鏈及兩個(gè)調(diào)節(jié)性輕鏈（MRLC）。在脊椎動(dòng)物中NMMHC-Ⅱ具有3種亞型，分別為NMMHC-ⅡA、-ⅡB、-ⅡC，并且在不同組織中表達(dá)各不相同［26］。在哺乳動(dòng)物甲狀腺中，NMMHC-ⅡA可作為肌球蛋白Ⅱ的編碼基因；而肌球蛋白Ⅱ的激活/活化通過MRLC Ser19磷酸化實(shí)現(xiàn)［27］。相關(guān)研究表明，在缺氧、營養(yǎng)剝奪等應(yīng)激條件下，DAPK2通過磷酸化底物MRLC激活肌球蛋白Ⅱ，隨后MRLC的磷酸化可進(jìn)一步作用并激活A(yù)TG9A，參與啟動(dòng)細(xì)胞自噬，促進(jìn)自噬小體形成［24，28］。甲狀腺組織ATG9A mRNA及蛋白表達(dá)隨MRLC的磷酸化/活化而升高。本研究中，我們檢測(cè)暴露于PCB118后NMMHC-ⅡA、ATG9A表達(dá)及MRLC磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)甲狀腺組織MRLC磷酸化與ATG9A mRNA及蛋白表達(dá)變化一致，提示ATG9A可能隨MRLC的磷酸化/活化而升高。WANG等［21］通過慢病毒過表達(dá)Tubb3及小干擾RNA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCB118可通過Tubb3/DAPK2/MRLC/ATG9A通路介導(dǎo)甲狀腺FRTL-5細(xì)胞自噬反應(yīng)。本研究在前述研究基礎(chǔ)上通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，PCB118可能同樣誘導(dǎo)甲狀腺組織主要發(fā)生以下系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即異常表達(dá)的Tubb3結(jié)合并激活DAPK2，促進(jìn)MRLC磷酸化和ATG9A表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)自噬反應(yīng)。

綜上所述，自噬在慢性低濃度［0～1 000 μg/（kg·d）］PCB118導(dǎo)致大鼠甲狀腺組織損傷中起重要作用，其作用機(jī)制可能與Tubb3/DAPK2-相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。然而PCBs誘導(dǎo)甲狀腺自噬的作用機(jī)制復(fù)雜，可能涉及其他信號(hào)途徑，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。