慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞表面T淋巴細胞Tim-3、TLR4表達變化觀察

葉青，趙敏，冉紫晶，張詩琬，梅小平

川北醫學院附屬醫院，四川南充637000

乙型肝炎病毒（HBV）為一種嗜肝病毒，其引發相關性肝病的發病機制尚不明確。最早的研究發現，TLR-4可直接介導機體與HBV等病原體間的免疫反應，在TLR-4識別HBV等受體后啟動細胞信號通路而促進特異性免疫反應，誘導相應細胞因子分泌而發揮抗HBV等作用，導致肝組織炎癥反應的發生。研究發現，外周血單核細胞（PBMCs）表面及肝組織中均可檢出不同水平的HBV表達，其HBV誘導了肝細胞損傷，這可能與HBV基因型變異、病毒蛋白水平高表達、宿主過度的抗HBV免疫反應、腫瘤壞死因子介導的肝細胞凋亡和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用等因素相關。在CHB等肝病患者中宿主抗HBV的過度免疫反應是目前較公認的肝臟損傷機制之一［1］。研究發現，Tim基因有8個基因亞型，共編碼4種蛋白，人類僅編碼Tim-1、Tim-3和Tim-4三種基因亞型，其中Tim-3為一種負性調節蛋白質，常表達于激活后的單核細胞等表面，Tim-3配體可與HBV等病原體結合參與免疫反應的調節［2］。研究發現，Tim-3在T淋巴細胞表面失常性表達與CHB患者免疫功能紊亂等密切相關，可能是CHB等肝病患者的發病機制之一［3］。Tim-3和TLR-4均在單核細胞表面廣泛表達，其在CHB中的研究為目前的熱點之一，但二者與CHB病情的關系仍無定論。本研究以CHB患者為研究對象，以無HBV感染的健康體檢者、HBV攜帶者為對照進行研究。觀察其外周血中PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平表達變化，并探討其二者之間及二者與CHB病情嚴重程度的相互關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年1月-2020年8月在川北醫學院附屬醫院門診或住院部就診的CHB患者190例（CHB組），同期25例HBV攜帶者（攜帶組）及25例無HBV感染的健康體檢者（健康組），診斷標準為2015年中華醫學會肝病學分會制定的CHB防治指南［4］，依據傳染病學第九版對CHB患者病情程度進行分度。納入標準：研究對象均知情同意者；近6個月CHB患者均未接受免疫與抗HBV治療。排除標準：合并其他嗜肝或非嗜肝病毒感染；不明原因肝炎；妊娠期或者哺乳期婦女。CHB組中男139例、女51例，年齡18～68（40.21±15.26）歲，CHB輕度組、CHB中度組、CHB重度組分別為90、70、30例。健康組中男16例、女9例，年齡18～67（41.08±14.08）歲；攜帶組中男17例、女8例，年齡18～60（41.39±16.39）歲。三組年齡、性別構成比比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

1.2 PBMCs表面Tim-3、TLR-4的檢測采集研究對象外周靜脈血3 mL后，分離PBMCs采用Ficol-Hypaque密度離心法，用Ficoll-hypzue分離液（淋巴細胞分離液）分離PBMCs，以0.01 mol/L PBS洗滌細胞，將PBS液一倍稀釋后加至淋巴細胞分離液上層，以2 500 r/min轉速離心25 min后采取單核細胞和淋巴細胞富集層，2次用PBS再洗滌后即可獲取PBMCs并儲存于-80℃冰箱中保存備用。

用流式CD16、CD56和Tim-3及單標和同型對照標志物加入3 mL UPBMCs中，用4%多聚甲醛溶液500 μL固定后上機檢測，并獲取PBMCs表面Tim-3的表達水平。將CD14、CD282、TLR-4抗體、同型對照物加入UPBMCs中混勻，避光孵育30 min加入PBS液離心兩次后棄上清液，4%多聚甲醛溶液固定后置于流式細胞儀上，選定單核細胞門檢測TLR-4。

1.3 血清中HBV感染標志物及肝功能檢測采用德國西門子公司生產的ADVIA 2400全自動生化分析儀及配套試劑檢測肝功能指標。乙型肝炎病毒感染血清學標志物檢測試劑為Abbott公司產品；HBV DNA Taqman熒光定量PCR試劑為上海申友生物技術有限責任公司產品。

1.4 統計學方法采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析；采用Pearson法分析各因素間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平比較CHB患者外周血PBMCs表面Tim-3、TLR-4表達水平均高于健康組和攜帶組（t1=-13.705，t2=-13.412；t1=-28.767，t2=-28.044P均＜0.05），結果見表1。

表1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平（±s）

表1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平（±s）

組別CHB組攜帶組健康組n 190 25 25 Tim-3（pg/mL）332.06±179.73 112.58±61.07 115.86±56.49 TLR-4（ng/mL）12.81±8.62 1.25±0.14 1.04±0.99

2.2 CHB患 者PBMCs表面Tim-3及TLR-4與 患 者病情的關系CHB輕度組、CHB中度組、CHB重度組PBMCs表面Tim-3水平分別為（206.38±17.15）、（387.91±42.50）、（695.72±93.12）pg/mL，TLR-4分 別為（6.37±1.25）、（12.29±1.43）、（18.01±1.34）ng/mL，不同組間兩兩比較，P均＜0.05。

PBMCs表 面Tim-3及TLR-4均與病情程 度呈正相關（r分別為0.916、0.917，P均＜0.05）。

2.3 CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平之間及其與肝功能指標之間的關系CHB患者PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平間呈正相關（r=0.318，P=0.000）。Tim-3水平與ALT［（406.47±337.68）U/L］、AST［（303.78±294.52）U/L］均 呈 正 相 關（r=0.940，P=0.000；r=0.928，P=0.000），TLR-4水平與ALT、AST水平也呈正相關（r=0.318，P=0.000；r=0.341，P=0.000）。Tim-3及TLR-4水平與HBV DNA［（5.61±1.94 IU）/mL）］呈負相關（r=-0.374，P=0.000；r=-0.152，P=0.000）。

3 討論

CHB患者免疫功能紊亂可能是機體不能完全清除HBV或炎癥反應發生與慢性化的原因之一［5-6］，肝細胞的免疫損傷是CHB等HBV相關性肝病患者肝損傷的主要發生機制。研究發現，Tim-3對CHB等患者的免疫功能發揮著負向調控作用，在與半乳糖凝素-9結合后為T淋巴細胞等單核細胞提供負性共刺激信號并形成信號傳導通路，調節Th1、Th2及Th17等細胞因子活性與水平表達，從而通過降低促炎性因子水平來調控適應性炎癥反應與纖維化的發生［7］。研究發現，模式識別受體族中最重要的受體之一是TLRs受體，可在識別HBV等病原體后發揮免疫功能的調節作用［8］。TLRs模式識別受體家族中至少有10種，TLR-4受體為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于主要表達于單核細胞等細胞表面的TLRs，可發揮人體固有免疫應答的調節作用，對分布于肝星狀細胞（HSC）膜上TLRs，可通過激活HSC標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），從而發揮下調膠原蛋白基質蛋白酶-2（MMP-2）水平的作用，進而促進HSC激活并轉化為成肌纖維細胞而使膠原纖維蛋白原上調，導致肝組織炎癥發生與肝纖維化形成。研究發現，在肝組織炎癥發生形成時，其外周血LPS可上調TLR-4表達水平，并與肝組織炎癥的發生及炎癥程度密切相關，在一定程度上反映了CHB患者病情程度［9］。CHB等患者PBMCs表面的Tim-3在免疫功能調節方面發揮了負向調控作用，Tim-3與相應受體結合后為受感染細胞提供負性共刺激信號并激活相關信號通路，抑制Th1細胞活性而促進炎性因子水平下調，通過Th17細胞發揮抑制適應性炎癥反應的作用，從而對CHB患者炎癥反應的發生、發展及程度發揮調節作用。

本研究結果顯示，CHB患者PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平與HBV DNA載量間呈負相關系（r=-0.374，P=0.000；r=-0.152，P=0.000），與 喻 雪 琴等［5-10］的研究結果相一致，這可能與CHB等HBV相關性肝病患者體內HBV長期存在相關，HBV在與肝細胞核結合后，外周血中游離的HBV水平低表達，此時Tim-3及TLR-4高表達于單核細胞表面，特別是CD8+T細胞，通過觸發Galectin-9而引發自身凋亡，導致淋巴細胞耗竭而降低抗HBV的作用，從而使乙肝病程慢性化。另外，低水平表達的HBV在機體內持續存在，也可通過多路徑來誘導激活HSC，導致肝細胞受損后的炎癥反應和纖維化的發生，從而啟動PBMCs表面Tim-3及TLR-4活化進程并高水平表達，抑制HBV DNA復制。研究發現，肝組織內Tim-3及TLR-4水平可隨CHB患者外周血HBV DNA載量增加而上調，提示HBV DNA水平與Tim-3、TLR-4水平關系密切［11］。不過也有研究結果顯示，CHB患者外周血中HBV DNA載量與PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平無明確關系［12］。因此，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平與HBV DNA載量間關系仍不清楚，還需多中心、大樣本等研究以明確。

本研究結果表明，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4高表達，說明其水平與肝組織炎癥發生及程度有密切關系。CHB的炎癥發生是向肝硬化發展的一個中間過程，也誘導Tim-3及TLR-4等大量促炎性因子高表達，促進和加重了肝組織炎癥反應的發生。因此認為，PBMCs表面是Tim-3及TLR-4的常見表達位置，在白細胞的中性粒細胞表面不表達或低水平表達，提示靶細胞免疫損失主要是通過PBMCs表面的Tim-3及TLR-4來 完 成 的，在CHB中發揮通過抑制過度免疫反應來誘導肝損傷和抑制宿主細胞對HBV清除的雙重作用，通過HBV感染后炎癥反應的發生和持續而導致慢性化，為此通過調節Tim-3及TLR-4表達水平可能會對CHB患者炎癥反應的發生及肝纖維化形成發揮調節作用。

本研 究結 果 顯示，Tim-3、TLR-4在CHB患者PBMCs表面的表達水平較健康組明顯升高，并隨CHB病情程度加重而逐漸高表達，Tim-3及TLR-4表達水平與CHB患者病情程度呈正相關，提示PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平表達與機體感染HBV后的炎癥發生關系密切，可以反映肝組織炎癥反應的發生與病情程度，與趙小瑜等［10］的研究結果一致。本研究結果顯示，CHB患者外周血PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平間正相關，提示同為負性免疫調節因子的Tim-3與TLR-4間具有明顯的協同作用，可協同參與CHB患者肝組織炎癥的免疫損傷過程。同時在CHB的急性肝損傷時，TLR-4還可通過識別HBV產生免疫反應介導肝細胞損傷，另外，在CHB慢性炎癥時TLR-4還可能通過識別LSP介導肝細胞的損傷，提示通過病毒識別并不是致肝細胞損失的惟一路徑。

有研究結果顯示，隨著CHB病情程度加重，患者腸道菌群紊亂明顯，厭氧菌減少而腸桿菌過度生長，并移行入血，致大量LPS產生，而LPS正是TLR-4的配體，在與其結合后使TLR-4信號通路活化，促進TNF-α等炎性因子水平高表達，致巨噬細胞等炎性細胞趨化入肝臟，誘導和促進了肝細胞損傷。本研究結果顯示，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平表達與肝臟炎性指標均呈正相關系（P＜0.05），其中Tim-3水平與炎性指標相關性更強，與魏卓等［13］研究結果相一致，提示Tim-3與TLR-4可作為肝組織炎癥程度的評估指標之一。

綜上所述，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平升高，TIm-3、TLR-4表達呈正相關，二者與CHB患者病情及肝臟炎性程度相關。本研究僅探討了CHB患者PBMCs表面表Tim-3、TLR-4水平變化，未做肝組織中Tim-3、TLR-4水平檢測及與肝纖維化程度的關系分析，也未分析CHB患者肝組織中Tim-3及TLR-4表達水平與循環血中Tim-3、TLR4水平關系。TLR-4受體作為引起CHB免疫損傷的靶點之一，適時沉默或上調TLR-4水平可能是CHB患者免疫治療的潛在發展方向。PBMCs表面Tim-3水平高表達后可下調免疫功能，誘導免疫耐受致CHB患者肝組織炎癥發生與慢性化，另外，在上調或沉默Tim-3水平后肝組織炎癥將如何變化？是否可通過調節Tim-3水平表達來治療CHB患者尚需進一步研究。