杜仲皮水提取物及醇提取物預灌胃大鼠肝臟缺血再灌注處理后肝損傷情況觀察

范國鑫，馮贊杰，彭慈軍，張世龍，段玉靈，李凱

1遵義醫科大學附屬醫院，貴州遵義563000；2遵義醫科大學生物化學與分子生物學教研室

肝臟缺血—再灌注損傷（HIRI）是指缺血肝臟在恢復血液灌注后破壞的結構和功能不僅沒有恢復反而加重的現象。氧化應激和炎癥反應是推動HIRI發生發展的重要因素。目前HIRI是制約肝外科手術發展的重要原因之一［1-2］。HIRI保護研究主要包括藥物預處理、缺血預處理等，其中中藥預處理是目前研究的熱點。杜仲皮在我國已有2 000多年藥用歷史，是名貴滋補藥材，主要功效包括增強免疫力、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗肝纖維化、抗炎等［3-4］，杜仲皮提取物能否通過抗氧化抗炎作用發揮對HIRI的保護作用，目前尚未有文獻報道。因不同提取方式所提的杜仲皮提取物成分不同，其效用也可能不同。2019年12月—2020年9月，我們觀察了杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃大鼠肝臟缺血再灌注處理后肝臟的損傷情況；并檢測了不同劑量的杜仲皮水提取物及醇提取物預處理后，大鼠肝組織中的炎癥反應指標（IL-1β、TNF-α）、氧化應激指標［總超氧化物歧化酶（SOD）、脂質氧化酶（MDA）］及Caspase3蛋白，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器雄性SPF級SD大鼠64只，（200±20）g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2019-0011。飼養于遵義醫科大學實驗動物中心。杜仲皮購自遵義醫科大學附屬醫院藥劑科。MDA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛購自北京麥瑞博生物科技有限公司。干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司），全波長酶標儀（ther‐mo，美國），高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司），生物顯微鏡（leica，德國）。

1.2 杜仲皮水提取物及醇提取物的提取杜仲皮水提取物及醇提取物制作方法參照高銀輝等［5］方法進行，水提取物提取方法為8倍質量雙蒸水浸泡藥材2 h后，加熱回流煮沸2 h后抽取溶劑，過濾，相同步驟重復一次，合并兩次濾液過濾濃縮后放入4℃冰箱備用。杜仲皮醇提取物除溶劑換為60%乙醇外其余提取步驟相同，濃縮至無醇味，用于后續灌胃。

1.3 大鼠分組、杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃、肝臟缺血再灌注處理64只雄性SPF級SD大鼠隨機分為8組（假手術組，HIRI組，水提取物高、中、低劑量組，醇提取物高、中、低劑量組），每組8只。假手術組、HIRI組使用雙蒸水進行灌胃，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組使用杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃，杜仲皮水提取物及醇提取物高、中、低劑量使用濃度均為80 g生藥/（kg·d）、40 g生藥/（kg·d）、20 g生藥/（kg·d）。各組均連續灌胃10 d。使用10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉大鼠后，除假手術組外其余各組均用顯微止血夾阻斷肝中葉及左肝葉血流造成大鼠70%肝臟缺血，缺血時間為1 h，再灌注時間為4 h，假手術組開腹后僅解剖十二指腸韌帶。

1.4 血清ALT、AST的檢測各組大鼠于再灌注4 h時（假手術組開腹5 h時），麻醉下頸椎脫臼法處死大鼠，下腔靜脈取血室溫放置2 h后4℃1 000×g離心15 min，取上清（血清）存放于–80℃冰箱備用，由遵義醫科大學附屬醫院檢驗科使用全自動生化儀檢測血清ALT、AST。

1.5 肝組織病理學觀察及IL-1β、TNF-α、MDA、SOD的檢測各組大鼠均取左肝葉，部分肝臟使用10%中性甲醛固定24 h后送由遵義醫科大學附屬醫院病理科制作切片及HE染色，其余部分存放于–80℃冰箱。采用ELISA法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β；硫代巴比妥酸法測定肝組織中MDA；黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織中SOD。

1.6 肝組織Caspase3蛋白的檢測HIRI組、水提取物高劑量組、假手術組大鼠取肝臟組織加入組織重量9倍的0.86%預冷生理鹽水，在SCIENTZ-48高通量組織研磨器中充分研磨（15 000 r/min，10 s，5次），離心10 min（4℃，13 000 r/min），吸取上清液（肝勻漿）用于后續檢測或-80℃保存。Westernblotting法檢測肝組織中Caspase3蛋白。

1.7 統計學方法采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較，方差齊使用LSD-t檢驗，方差不齊使用Dunnett，sT3檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠病理學觀察結果及血清ALT、AST水平比較各組大鼠肝臟HE染色結果如圖1，假手術組（圖1A）肝索排列整齊，肝細胞大小形態正常；HIRI組（圖1B）肝索排列紊亂，部分肝細胞明顯壞死；水提取物高、中、低劑量組（圖1 C、圖1D、圖1E）及醇提取物高、中、低劑量組（圖1F、圖1G、圖1H）肝索排列紊亂及肝細胞壞死程度均較HIRI組減輕。

與假手術組比較，HIRI組血清ALT、AST水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組AST、ALT水平降低（P均＜0.05）。水提取物及醇提取物高劑量組AST、ALT水平低于水提取物及醇提取物中、低劑量組（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組AST水平比較，P＜0.05；ALT水平比較，P＞0.05。各組大鼠血清ALT、AST水平見表1。

2.2 各組肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較與假手術組比較，HIRI組肝組織IL-1β、TNF-α水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平降低（P均＜0.05）。水提取物及醇提取物高劑量組IL-1β、TNF-α水平低于水提取物及醇提取物中、低劑量組（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組TNF-α水平比較，P＜0.05；IL-1β水平比較，P＞0.05。與 假 手術 組 比 較，HIRI組 肝組 織MDA、SOD水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組MDA水平降低、SOD水平升高（P均＜0.05）。水提取物高、中、低劑量組MDA、SOD水平無統計學差異（P均＞0.05），但具有濃度依賴趨勢。醇提取物高劑量組MDA水平低于醇提取物中、低劑量組，醇提取物高劑量組SOD水平高于醇提取物中、低劑量組，（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組MDA水平比較，P＜0.05；SOD水平比較，P＜0.05。各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD詳見表2。

圖1 電鏡下各組大鼠肝臟組織表現（HE染色，×20）

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平（±s）

組別水提取物高劑量組水提取物中劑量組水提取物低劑量組醇提取物高劑量組醇提取物中劑量組醇提取物低劑量組HIRI組假手術組n 8 8 8 8 8 8 8 8 ALT（U/L）411.83±102.31 724.57±131.23 747.75±105.45 426.14±278.00 1 242.17±250.47 1 058.33±192.44 1 871.00±248.09 147.25±57.21 AST（U/L）354.67±165.95 745.14±186.78 764.75±170.39 936.29±148.23 1 145.33±187.45 1 164.00±156.50 1 521.75±133.82 45.75±22.23

2.3 各組Caspase3蛋白相對表達量比較水提取物高劑量組、HIRI組、假手術組Caspase3蛋白相對表 達量分 別為0.98±0.12、1.31±0.20、0.80±0.14。與假手術組相比，HIRI組Caspase3蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與HIRI組相比，水提取物高劑量組Caspase3蛋白相對表達量降低（P＜0.05），各組Caspase3蛋白相對表達量見圖2。

表2 各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平（±s）

表2 各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平（±s）

組別水提取物高劑量組水提取物中劑量組水提取物低劑量組醇提取物高劑量組醇提取物中劑量組醇提取物低劑量組HIRI組假手術組n 8 8 8 8 8 8 8 8 IL-1β（ng/L）67.73±15.00 75.42±16.28 94.45±22.97 73.42±18.66 88.61±13.69 102.44±21.83 123.33±15.45 49.12±9.17 TNF-α（ng/L）250.82±31.52 289.55±33.93 319.75±33.30 285.76±20.99 299.49±30.08 323.54±25.31 438.55±27.30 203.60±43.47 MDA（μmol/gprot）0.18±0.02 0.20±0.03 0.21±0.05 0.21±0.03 0.33±0.08 0.35±0.06 0.58±0.10 0.19±0.05 SOD（U/mgprot）232.62±17.92 215.31±7.66 217.79±18.69 211.32±14.68 189.14±13.68 183.18±16.86 184.20±19.13 251.18±23.35

圖2 HIRI組、水提取物高劑量組、假手術組Caspase3蛋白電泳圖（Western-blotting法）

3 討論

隨著肝外科手術的精細化和復雜化，多數肝臟手術都需要暫時阻斷肝臟血流，HIRI成為影響患者肝臟手術預后的重要因素［5-6］。現有研究認為，HIRI發生發展機制錯綜復雜，主要涉及到的機制包括氧化應激、炎癥反應、線粒體功能紊亂、Kupffer細胞激活、血管細胞黏附分子過表達等［7-8］。

杜仲作為我國特有的藥用植物，針對杜仲皮的藥用研究表明杜仲皮具有抗炎、抗氧化作用，而氧化應激及炎癥反應是缺血—再灌注損傷的兩個重要環節。已有研究表明，杜仲皮提取物可以通過降低機體氧化應激及炎癥反應水平起到對腦缺血-再灌注損傷的保護作用［9］肝臟組織病理學檢查是判斷肝臟結構損傷的金標準，而ALT、AST測定可以很好地反映肝臟功能損傷情況。MDA和SOD是反映機體氧化應激情況的兩個重要指標，MDA是機體的氧化產物，生成量與細胞受損程度成正比，而SOD反映機體對自由氧的清除能力，與細胞氧化損傷程度成反比。IL-1β、TNF-α是反映機體炎癥反應的重要指標。本研究發現，杜仲皮水提取物及醇提取物可以對HIRI起到防治作用，可能是通過減少MDA生成，升高SOD水平減輕HIRI氧化應激反應，降低IL-1β、TNF-α減輕炎癥反應以及改善肝臟結構和功能損傷而實現。本研究發現，水提取物高劑量組MDA、TNF-α、AST水平低于醇提取物高劑量組，SOD水平高于醇提取物高劑量組，此外除醇提取物低劑量組外，其余提取物預處理組MDA水平和假手術組相比差異并無統計學意義，提示杜仲皮提取物在降低MDA水平方面具有較強作用。研究還發現，給藥劑量越高其防治作用越強，水提取物高劑量組Cas‐pase3蛋白表達水平明顯降低，提示水提物通過抑制細胞凋亡途徑起到對HIRI的保護作用。但各組杜仲皮提取物在升高肝臟SOD水平方面并未呈現出如降低MDA水平般效果，經查閱相關文獻，發現杜仲皮提取物除可以升高SOD水平外，同時也升高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，GSH-Px也是機體清除氧自由基的重要蛋白［10］。杜仲皮提取物在HIRI中降低MDA水平的能力可能是由SOD及GSHPx共同介導。由于提取工藝不同，水提取物和醇提取物中所含成分并不一致，杜仲皮提取物主要含有總多糖和總黃酮，多糖易溶于水，總黃酮易溶于醇。有研究表明杜仲多糖可以明顯降低氧化應激水平［11-12］。此外，陳玉甫等［13］通過比較杜仲皮醇提取物及水提取物中桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸與綠原酸四種主要活性成分發現，醇提取物中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸與綠原酸含量高于水提取物，但差值不到1倍，而京尼平苷在水提取物中含量約為醇提取物中含量的5倍。有研究報道京尼平苷具有較強抗氧化能力，可以通過降低氧化應激水平減輕大鼠心肌再灌注損傷［14］，因此，我們推測水提取物發揮更好的保護作用可能和含有較高濃度多糖及京尼平苷有關。

綜上所述，杜仲皮提取物可減輕氧化應激損傷和炎癥反應，改善大鼠HIRI，保護效應呈劑量相關性，且水提取物的保護作用優于醇提取物；另外，本研究發現杜仲皮水提物可減少HIRI過程中Cas‐pase3表達，抑制細胞凋亡，但其具體機制仍不明確，需進一步深入研究。