嗜酸乳桿菌與復方緩潰樂混懸劑灌胃對潰瘍性結腸炎大鼠腸損傷的修復作用觀察

卡思木江·阿西木江，庫爾班乃木·卡合曼，希林古麗·吾守爾，吳桂霞，許晨波，庫熱西·玉努斯

1新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，烏魯木齊830017；2新疆醫科大學第一附屬醫院；3新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室；4新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室；5新疆醫科大學維吾爾醫學院

潰瘍性結腸炎（UC）是一種難治性非特異性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病（IBD）的一個亞類［1-2］，UC是以腸黏膜或黏膜下持續發炎為主要特征，腹痛、腹瀉、體質量減輕、腸道出血和便血等為主要癥狀［3］。UC的發病率近年來在全球呈上升趨勢，尤其在過去幾十年中，發展中國家的發病率迅速上升［4-7］。宿主的免疫應答在UC的發生、發展和延續過程中起著重要作用。免疫耐受的喪失會引起促炎因子和抗炎因子間的平衡失調，尤其是各種促炎介質的增加而引起局部和全身性炎癥［8-9］。T淋巴細胞（簡稱T細胞）是參與免疫—炎癥反應的主要免疫細胞，T細胞的分化紊亂導致效應T細胞和調節性T細胞之間的失衡，從而導致炎癥［10］。先前的研究表明，CD4+T細胞的亞群Th1和Th2細胞的平衡在UC的發生中起關鍵作用［11-12］，近期研究認為，產生IL-17的Th17型細胞以及調節性T細胞（Treg）均在UC的發病中發揮重要作用［13-14］。腸道黏膜的局部炎癥可促進T細胞活化，活化的T細胞可能攻擊UC患者腸道黏膜中的靶標，導致組織破裂并進一步加重炎癥的發生，產生惡性循環［15］。因此調控T細胞亞群失衡可能在預防和治療UC過程中具有重要的意義。2018年6月—2020年6月，本研究在TNBS誘導的大鼠UC模型的基礎上，用復方緩潰樂混懸劑（HKL）和嗜酸乳桿菌（Lac）對大鼠UC進行灌胃干預，觀察Lac與HKL灌胃對UC大鼠損傷腸黏膜的修復作用；用流式細胞術檢測UC大鼠和各干預組大鼠腹主動脈血T細胞亞群的變化來分析干預治療對大鼠免疫功能的影響，以探討HKL、Lac干預對UC大鼠損傷腸黏膜修復作用的相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑、儀器SPF級雄性Wi‐star大鼠，體質量（200±20）g（由新疆醫科大學實驗動物中心提供），晝夜節律12 h/12 h，每籠5只大鼠，適應性喂養一周，整個實驗過程中所有大鼠的飼養條件保持一致，保持室內溫度（25±3）℃，相對濕度60%～80%，自由飲食水。凍干型乳酸菌粉-Lac（簡稱Lac），檢驗合格證號：JYS-2019350，批號：190703，檢驗依據：Q/ZKJY0001S；乳酸菌活菌總數=1.44×1010cfu/g，大腸桿菌MPN/g符合規定，水分5.7 %。菌種組成：Lac；載體：低聚異麥芽糖）；HKL［稱取不同重量的黃連、石榴花、琥珀、沒食子、天竺黃、赤石脂、拳參、血竭、溫桲子、車前草子分別粉碎后過100目篩，將溫桲子（8 g）與車前草子（15 g）混合后至于70 mL玫瑰花露中浸提6 h（溫度80～90℃），過濾后收集濾液，每2 mL濾液中添加0.36 g按比例混合的琥珀、天竺黃、石榴花、赤石脂、黃連、拳參、沒食子、血竭，充分混勻，即制備得到治療UC的中藥組合物。給藥劑量為1.8 g/kg（藥物制備工藝已申請專利，專利號：201810790421.7）］。TNBS購自Sigma公司；乙醇、DXflex流式細胞儀（貝克曼）；EDTA真空抗凝采血管；紅細胞裂解液（BD公司）；CD3、CD4、CD8抗體（BD公司）；CD4、CD25表面抗體；磷酸鹽（PBS）緩沖溶液（pH 7.2～7.4）；TF Fix/Perm Work‐ing Solution（BD公司）；Perm/Wash Working Solution（BD公司）；流式細胞術抗體（BD Biosciences）；細胞核流式抗體Foxp3（BD公司）。低溫離心機（PPendorf）。

1.2 大鼠分組、UC模型的建立及Lac、HKL灌胃方法按完全隨機法將90只大鼠分為正常組（n=10）和TNBS造模組（n=80）。參照MORRIS等［16］的方法制作TNBS/乙醇誘導的大鼠UC模型，具體方法如下：將大鼠禁食24 h后麻醉，5 %的TNBS溶入等體積50%的無水乙醇后，利用石蠟潤滑的內徑1.5 mm的硅膠灌緩慢注入保持仰臥姿勢的造模組大鼠結腸內（離肛門約8 cm處），注入完成后，輕輕拔出硅膠管并立即捏緊肛門使大鼠呈倒立姿勢保持1 min左右，以保證TNBS/乙醇混合液能充分吸收后將大鼠放入干凈的鼠籠內，正常組大鼠注入相應體積的0.9%氯化鈉溶液灌腸，造模結束后將大鼠放入清潔籠內，待其自行清醒，自由飲水。造模后第2天觀察大鼠的一般精神狀態，并檢測體質量，然后分別從正常組和TNBS造模組隨機挑選2只大鼠，取結腸組織做病理切片，電子顯微鏡下見潰瘍形成，證實結腸炎形成。再將TNBS造模組隨機分為4組：UC組、Lac組、HKL組、LH組（0.21 g/kg Lac+1.8 g/kg HKL）。建立UC模型后正常飼養，隨機飲水，造模第3天開始用普通鼠飼料飼養；正常組和UC組給予等量的蒸餾水，Lac組灌胃0.21 g/kg的Lac，HKL組 灌 胃1.8 g/kg HKL，LH組 大 鼠 灌 胃0.21 g/kg的Lac，0.5～1 h后再灌胃1.8 g/kg HKL，均每日2次，連續14 d。

1.3 結腸組織組織病理學檢查干預結束后將大鼠麻醉，分離取出距離肛門8 cm處的結腸組織，沿腸系膜縱形剪開腸腔，用預冷好的生理鹽水迅速沖洗干凈，吸干水分，展平觀察，并將組織縱切成兩半，經固定、脫水、包埋、取4 μm組織切片，進行HE染色，參照AUTENRIETH等［17］的組織學評分標準，由病理科專業人員盲法閱片，評分為4個等級，評分越高，表明黏膜損傷及炎癥程度越高。

1.4 大鼠腹主動脈血中T細胞亞群的檢測用EDTA真空抗凝采血管抽取大鼠腹主動脈血1～2 mL，靜置20 min后用流式細胞術檢測。①細胞表面染色法檢測T淋巴細胞亞群：100μL抗凝全血中分別加入5 mL的CD3、CD4、CD8抗體，孵育；裂解紅細胞后用PBS洗滌并離心，棄上清；重懸細胞并上機檢測。②胞內染色法檢測Th1/Th2/Th17細胞比例。刺激細胞活化后加CD4表面抗體；裂解紅細胞并進行細胞固定和破膜；胞內染色，重懸細胞，上機檢測。③細胞核內染色法檢測Treg淋巴細胞比例。100μL全血中分別加入5 mL CD4、CD25表面抗體，孵育；裂解紅細胞后用PBS洗滌并離心，棄上清；細胞固定和破膜后清洗，離心，棄上清；加抗體Foxp3，孵育，棄上清，重懸細胞并上機檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進一步比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態、大體、組織病理學觀察結果與正常組相比，UC組造模后第2天起出現食欲減退、精神萎靡、活動量減少等現象，大部分大鼠出現稀便、黏液膿血便，體質逐漸變得虛弱、體質量下降。正常組、UC組、HKL組、Lac組、LH組初始體質量分別為（226.4±12.6）、（228.4±19.5）、（232.5±8.4）、（227.9±13.2）、（230.4±20.6）kg；治療第14天的體質量分別為（283.2±15.7）、（236.1±24.0）、（268.0±17.9、（260.4±13.4）、（274.0±20.7）kg。干預結束時，與正常組相比，UC組大鼠體質量降低（P均＜0.01）；與UC組相比，干預組大鼠體質量均增加，其中LH組和HKL組大鼠體質量增加最明顯（P均＜0.01）。

大體標本觀察結果：UC組大鼠結腸表現為凹凸不平、結腸明顯縮短、異常變大、病變部位腸壁增厚、壞死水腫，部分大鼠結腸顏色發黑、有糜爛與腸粘連、管壁僵硬，病變壞死區域平均2 cm左右。Lac組大鼠的結腸損傷程度有改善，有輕度至中度水腫，個別大鼠腸壁有糜爛、增厚現象，部分組織有小出血點。LH組和HKL組部分大鼠結腸表面有輕度水腫、少數有充血、腸壁增厚已有明顯改善，結腸組織損傷改善比較明顯，其中LH組大鼠損傷減輕程度最為明顯，見圖1。

組織病理學觀察結果：LH組、Lac組、HKL組、UC組及正常組組織損傷程度評分分別為（1.17±0.71）、（1.79±1.02）、（1.29±0.70）、（2.56±0.66）、（0.08±0.24）分，與正常組比較，UC組組織損傷程度評分升高，與UC組比較，HKL組、LH組組織損傷程度評分降低（P均＜0.01）。

2.2 各組大鼠腹主動脈血T細胞亞群比較與正常組相比，UC組大鼠大鼠腹主動脈血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比均下降（P＜0.05），CD4/CD8比例降低，但差異無統計學意義（P均＞0.05）。與UC組相比，LH組和HKL組CD3+T細胞、CD4+T細胞比例上升（P均＜0.05）；與UC組相比，各干預組CD8+T細胞百分比無統計學變化（P均＞0.05），Lac組、UC組CD4+T細胞，CD3+T細胞比例比較，P均＞0.05，見表1。

圖1 各組大鼠結腸組織肉眼觀察所見

表1 各組大鼠腹主動脈血T淋巴細胞亞群（±s）

表1 各組大鼠腹主動脈血T淋巴細胞亞群（±s）

組別LH組HKL組Lac組UC組正常組n 6 6 6 6 6 CD3+44.02±1.86 49.89±5.40 39.33±6.78 35.09±5.71 56.04±6.35 CD3+CD4+35.32±3.65 36.20±4.11 28.95±3.51 27.75±6.31 39.08±5.71 CD3+CD8+14.17±1.79 15.93±2.61 14.17±4.91 14.57±2.09 19.60±4.28 CD4+/CD8+2.39±0.33 2.34±0.59 2.20±0.58 1.89±0.23 2.08±0.61

Th1細胞比例：與正常組比較，UC組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；LH組、HKL組和Lac組較UC組降低，但差異無統計學意義（P均＞0.05）。Th2細胞比例：UC組比正常組升高（P＜0.05），LH組、HKL組和Lac組較UC組降低（P＜0.05）。Treg細胞比例：UC組較正常組降低，但HKL組、Lac組和LH組較UC組升高（P＜0.05）。Th17細胞的比例：UC組比正常組升高（P＜0.05），各干預組比UC組降低（P＜0.05）。各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比見表2。

表2 各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比（±s）

表2 各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比（±s）

組別LH組HKL組Lac組UC組正常組n 6 6 6 6 6 Th1細胞1.21±1.06 1.30±0.70 1.33±1.03 2.11±1.79 1.12±0.40 Th2細胞2.85±1.26 1.94±0.35 2.31±31.12 6.97±3.57 3.22±1.70 Treg細胞4.84±1.43 5.94±0.86 3.68±0.84 1.75±1.32 4.89±1.25 Th17細胞1.16±0.23 1.05±0.20 2.02±1.44 4.02±0.96 1.74±0.71

3 討論

中藥被廣泛用于UC的治療［18］，由黃蓮、車前草子、石榴花、沒食子等十種中藥材所組成的中藥組合物HKL對大鼠UC具有一定的治療效果［19］。由于UC發病過程中腸黏膜屏障破壞和免疫系統異常激活均與腸道菌群失衡有關，因此除了需要基于調節免疫的治療外，輔助應用微生態調節劑調節腸道菌群失衡也尤為重要［20］。Lac作為一種十分重要的益生菌，其自身代謝產物能夠抑制病原微生物生長［21-22］。LEE等［23］在研究Lac對結腸炎的治療效果時發現，Lac可以降低TLR的表達，降低腸道炎癥反應，Lac能夠使TLRs表達、腸道菌群平衡及宿主健康三者之間處于最佳平衡狀態。研究報道顯示，治療UC過程中益生菌與傳統治療藥物聯合使用時對UC的治療效果更為明顯［24］。因此本研究在前期工作的基礎上假設益生菌和復方中藥的有效組合可能提高治療UC的效率。本研究通過大鼠結腸組織病理學分析發現，Lac雖然對大鼠結腸組織損傷具有一定的修復作用，但炎細胞浸潤程度比較重，炎細胞浸潤深度也覆蓋結腸全層，對大鼠UC的修復作用明顯低于LH組和HKL組，在結腸組織病理學、體質量和一般狀態等方面比較，聯合干預對UC大鼠的治療作用較為明顯，說明中藥HKL聯合Lac會提升單種藥物對UC的治療效果，具體作用機制有待于研究。

關于血液淋巴細胞亞群的研究表明，IBD中高度加劇的慢性炎癥與外周血T細胞活化增加有關，這表明局部腸道炎癥可能會刺激全系統的適應性免疫 反 應［25］。T細 胞 根 據CD分 子 的 表 達 分 類 為CD4+T細胞和CD8+T細胞，其中CD4+T的主要亞群是輔助性T細胞（Th），活化后主要通過分泌各種細胞因子輔助細胞免疫和體液免疫。CD8+T細胞主要是一類具有殺傷活性的效應細胞，稱為細胞毒性T細胞，發揮抑制細胞及體液免疫的作用。這兩種細胞的失衡與UC等自身免疫性疾病的發生發展密切相關［26］。本研究中通過流式細胞術檢測各組腹主動脈血中T淋巴細胞絕對計數，結果顯示UC組大鼠CD3+、CD4+均明顯下降，說明UC大鼠免疫力下降，同時CD4+/CD8+下降，說明UC大鼠的細胞免疫功能處于相對免疫抑制狀態，機體對被病毒感染的靶細胞和機體內產生的突變細胞的識別和殺傷能力下降。CD8+T細胞數量在UC活動期時較正常人或者緩解期患者顯著減少。UC大鼠進行藥物干預后，CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+均上升，Lac與HKL聯合干預后，UC大鼠的免疫功能逐漸恢復，說明Lac與HKL的聯合影響UC大鼠的細胞免疫功能狀態，改變原始T細胞的活化方向和程度。

Th細胞充當免疫應答的輔助或誘導劑。在正常情況下，體內的Th1和Th2細胞處于動態平衡并相互調節，從而維持體內環境的穩定。如果Th1和Th2細胞失去平衡，則炎癥會在組織和器官中發生并引起疾病。Th1和Th2細胞均由Th0細胞的分化而產生，IL-12及IFN-γ誘導Th0向Th1細胞分化，IL-4誘導Th0向Th2分化。本研究結果發現，與正常組相比，UC組大鼠Th2細胞的比例升高，Th1細胞有上升趨勢但差異無統計學意義，與晁康等［26-27］研究結果一致，提示可能Th2細胞在UC的發生發展中起著主要作用。

研究顯示，UC發病的關鍵因素是促炎細胞因子的高分泌和IL-23/Th17軸的異常激活［28］。Th17細胞是不同于Th1和Th2細胞的Th細胞亞群，其作為免疫反應的關鍵效應因子，通過產生IL-17等促炎細胞因子依次誘導嗜中性粒細胞向感染部位遷移，引起炎癥反應［29-31］。而Treg細胞通過調節效應T細胞的活性來協調整體免疫反應，在防止UC惡化中起重要作用，通過分泌和調節抗炎細胞因子來抑制炎癥反應的級聯并維持腸道免疫反應的平衡［32-33］。研究表明，這兩種細胞形成了一種免疫平衡，促進免疫系統的正常運作［34］。本研究中，UC組大鼠腹主動脈血Treg細胞比例較正常組明顯降低，Th17細胞比例明顯增加，而Treg/Th17降低，與SU等［34］研究結果一致。本研究中UC大鼠Th17和Treg細胞的平衡紊亂，說明局部炎癥不僅與結腸局部免疫有關，很有可能會引起全身免疫功能紊亂。在疾病緩解期間，血液中的CD4+CD25high和FOXP3+調節性T細胞有所增加，但在疾病活動期卻有所減少［35］，說明機體免疫反應跟疾病的階段有一定關系，本研究中Treg細胞減少說明UC大鼠可能處于疾病活動期。UC大鼠藥物干預后，各干預組大鼠腹主動脈血中的Treg細胞百分比均有不同程度的增加，Th17細胞百分比也均存在不同程度的下降，說明本研究中的各干預措施對UC大鼠產生的Treg/Th17平衡紊亂具有不同程度的調控作用。三種干預措施中，聯合干預調節Treg水平最接近于一般生理狀態，并且Treg/Th17的比例最接近于正常組水平，說明Lac和HKL的聯合可通過抑制UC大鼠Th17細胞的分化和促進Treg細胞的分化來調節Treg/Th17的平衡，Lac和HKL對UC干預的效果優于其他單用藥物。

綜上所述，HKL對UC大鼠腸黏膜損傷的修復作用優于Lac，Lac聯合HKL的修復作用最佳；Lac與HKL可能通過抑制血液中Th17細胞的分化、促進Treg細胞的分化而起作用。