治療子宮內膜異位癥的化瘀散結灌腸液活性成分篩選及其靶基因生物學功能分析

徐信，宗春曉，邢玉，徐立，祝潔，薛曉鷗

1北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700；2清華大學玉泉醫院；3北京中醫藥大學東方醫院

子宮內膜異位癥（EMs）是指具有活性的子宮內膜組織（腺體和間質）在宮腔被覆內膜以外存活并擴散的一種具有侵襲、種植等類似惡性腫瘤生長特性的良性疾?。?-4］。據文獻報道，育齡期女性中EMs發生率5%～10%［5］，合并不孕癥的為20%～30%［6］，并發慢性盆腔痛（CPP）的患者高達50%左右［7］?；錾⒔Y灌腸液為《醫宗金鑒》桃紅四物湯基礎之上化裁而成，具有活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結之功［8］。中藥保留灌腸是一種傳統、有效的給藥途徑，其可避免肝臟首過效應，減輕藥物對胃腸道的刺激［9］，同時，藥物能夠直達病灶，易于吸收、達峰時間短、起效迅速［10］。近年，臨床實踐驗證其對EMs具有良好的治療作用［8］，《2019年子宮內膜異位癥中西醫結合診治指南》中也對化瘀散結灌腸液進行強推薦，且專家共識度高達90.48%。然而，化瘀散結灌腸液中藥成分復雜多樣，其作用機制尚未見報道。

網絡藥理學作為新興藥理學研究方法，它涵蓋了系統生物學、計算生物學和網絡分析等多學科技術［11］，具有整體性及系統性的特點，這也與中藥組方配伍重視整體觀的原則十分契合［12］，顛覆了既往單靶點機制通路難以詮釋中藥復方多成分、多靶點協同作用的狀況［13］。目前，越來越多關于網絡藥理學的研究成功應用于中藥的機制探究，從宏觀整體和微觀機制闡釋了中藥多靶點、多環節、多效應的科學內涵［11-15］。2020年1—9月，本研究借助網絡藥理學的分析方法，針對化瘀散結灌腸液治療EMs的靶基因和機制進行了探索。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org/）；GeneCards數據庫（https：//www.gene‐cards.org）；STRING 11.0在線平臺（https：//stringdb.org）；生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8）；Cyto‐scape（版本：3.7.2）。

1.2 化瘀散結灌腸液活性成分的篩選化瘀散結灌腸液包含當歸、川芎、赤芍、熟地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術、丹參、鱉甲、龜板、木通、連翹、金銀花15味中藥。首先通過TCMSP數據庫查找中藥所包含的化學成分［16］，對于未收錄的鱉甲、龜板則檢索中國知網相關文獻進行補充，構建化學成分數據庫。但數據庫冗余龐雜，故引入ADME［17］進一步篩選其發揮藥效的重要活性成分。

采用TCMSP數據庫的ADME預測功能，對建立的化學成分庫進行活性成分篩選，此次研究藥品為灌腸液，因此篩選其腸上皮吸收好、與上市藥品中藥物接近程度高、生物利用度（OB）好的化學成分為活性成分［18］。設定的復合模型參數：腸上皮通透性（Caco-2 permeability，Caco-2）≥0.4、類藥 性（druglike，DL）＞0.36、OB≥30%。

1.3 化瘀散結灌腸液活性成分靶基因預測基于ADME獲得的活性成分，進一步通過TCMSP平臺預測其作用的靶標。得到的作用靶標統一在Uniprot蛋白質數據庫進行名稱規范。整理數據并刪除重復值后，所得結果即為化瘀散結灌腸液的活性成分靶基因。

1.4 治療EMs的化瘀散結灌腸液作用靶基因篩選以美國國家生物技術信息中心數據庫（Nation‐al Center for Biotechnology Information Search data‐base，NCBI）的Mesh主題詞表查詢EMs全面、規范的表達，得到“Endometriosis”、“Endometrioses”及“En‐dometrioma”作為EMs的關鍵詞，進而檢索Gene‐Cards數據庫，獲取與EMs相關的靶基因。

利用R語言將二者（藥物活性成分靶基因與疾病靶基因）取交集并繪制維恩圖，從而確定化瘀散結灌腸液治療EMs的作用靶基因，并將交集靶點信息提交至STRING 11.0在線平臺，生物種類設置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（置信度＞0.9），其余為默認設置，構建蛋白質互作網絡（PPI）網絡模型［19］。

PPI通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化呈現及分析，使用“CytoNCA”計算拓撲參數，并以連接度值（以Degree排序，其前十）作為節點重要性的量化參考，進而篩選藥物治療疾病的重要靶基因。

1.5 化瘀散結灌腸液治療EMs的重要靶基因生物學功能及信號通路分析將預測的化瘀散結灌腸液治療EMs的交集靶基因，利用DAVID［20］進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，尋找出化瘀散結灌腸液中治療EMs參與調控的信號通路及相關生物學過程，并以R語言繪制條形圖及氣泡圖。其中GO富集分析涵蓋分子功能（MF），細胞組分（CC）和生物過程（BP）三個部分［21］。

2 結果

2.1 化瘀散結灌腸液的活性成分及活性成分靶基因TCMSP數據庫查找的化瘀散結灌腸液所含中藥的化學成分：桃仁66個，紅花189個，當歸125個，川芎189個，赤芍119個，熟地黃76個，川牛膝41個，三棱30個，莪術81個，丹參202個，木通43個，連翹150個，金銀花236個。對于TCMSP數據庫未收錄的中藥，以CNKI收錄的相關文獻進行補充，其中龜甲和鱉甲所含的化學成分分別為20、16個；基于TC‐MSP數據庫的Caco-2、DL、OB參數共篩選出82個活性成分，刪除重復項為58個活性成分，包括β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、菜油甾醇等。得到的中藥活性成分通過TCMSP數據庫預測其潛在作用靶點，刪除重復項后得到110個化瘀散結灌腸液潛在作用靶基因，主要靶基因為PGR、NCOA2、PTCS2、SCN5A等。

2.2 治療EMs的化瘀散結灌腸液作用靶基因及重要靶基因最終獲得與EMs發病相關的靶基因1 446個。利用R語言相映射篩選出藥物活性成分靶基因與EMs相關基因的交集靶基因（重要靶基因），從而確定治療EMs的化瘀散結灌腸液55個作用靶基因。

PPI網絡中共涉及45個節點，197條邊，進一步根據網絡拓撲參數對節點重要度進行排序，其中排名靠前的依次為STAT3、JUN、TP53、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK14、FOS、ESR1、RELA等，見圖1。

2.3 重要靶基因的生物學功能及信號通路重要靶基因涵蓋BP 156條，CC 19條，MF 36條。GO生物學功能富集分析表明化瘀散結灌腸液治療EMs的藥效機制主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、藥物反應、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控、轉錄的正調控、雌二醇應答、缺氧反應等生物過程；細胞核、細胞質等重要的細胞組分；蛋白結合、酶結合、轉錄因子結合等分子功能。

圖1 治療EMs的化瘀散結灌腸液作用靶基因PPI圖

重要靶基因參與65條相關通路，包括癌癥相關信號通路、TNF信號通路、自噬、HIF-1信號通路（HIF-1）及PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt）等，其中癌癥相關信號通路不僅涵蓋交集靶標數量最多，且P值也最小，表明與交集靶點集合顯著相關。

3 討論

中醫古籍中并無EMs病名的記載，根據其臨床癥狀歸屬于“婦人腹痛、痛經、癥瘕”等疾病范疇。EMs雖為婦科良性疾病，卻具有類似惡性腫瘤的生物學特點，且復發率高，臨床治療棘手，對女性的身心健康及生存質量造成嚴重影響，故研究此病的治療具有重要的臨床價值和廣泛的社會學意義［22］。目前臨床上針對本病，尚缺乏理想的治療方法，手術治療復發率高，西藥治療不良作用多［23］。中醫藥強調整體觀念，治療EMs具有一定優勢，臨床研究亦表明，化瘀散結灌腸液能有效緩解疼痛、降低CA125水平、改善患者生活質量［8］，但尚鮮有相關機制的報道。本研究通過網絡藥理學，得出化瘀散結灌腸液治療EMs的靶點及機制。

化瘀散結灌腸液中的15味中藥涵蓋了58個活性成分，通過作用于55個交集靶點發揮對EMs的治療作用，其中STAT3、JUN、TP53、AKT1、TNF、VEG‐FA等蛋白，經拓撲參數分析，在PPI網絡中發揮重要作用，說明化瘀散結灌腸液可能主要通過這些蛋白發揮對EMs的潛在治療作用。有研究表明，激活后的STAT3持續進細胞核內，導致下游靶基因VEG‐FA高表達，可能通過促進局部病灶血管異常增生，導致EMs的發生［24］。TP53又名p53，是重要的抑癌基因。有研究表明，p53基因rs1042522位點多態性與EMs易感性相關［25-26］。馮婉琴等［27］發現，miR-34a-5p與AKT1基因在子宮內膜組織中的表達呈負相關，且miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因影響EMs的發病。JUN即AP-1蛋白，是一種細胞增殖相關的轉錄調節因子，通常由c-jun和c-fos蛋白以異源二聚體形式結合于啟動子區的AP-1位點上，與細胞的增殖與分化密切相關［27］。很多研究已證實AP-1參與腫瘤的形成、侵襲、轉移等過程，EMs具有類似的腫瘤的生物學特點，推測AP-1參與了EMs的發生、發展［28］。TNF是具有多種生物效應的一類細胞因子，通過與細胞膜上的受體結合，激活TNF信號通路，從而調控細胞生長、分化、調亡和誘發炎癥等過程［29］，研究表明，異位內膜可能刺激機體產生免疫反應，促使腹腔液中巨噬細胞增加，誘發其產生大量的TNF-α，促使間質細胞黏附、增殖，進而導致異位病灶［30-31］?？梢?，雖然目前EMs發生、發展、轉歸的機制仍未見定論，但可以看出多數研究的重點均依據EMs具有侵襲、轉移等類似惡性腫瘤的生物學特點進行展開。

此外，GO功能富集分析表明化瘀散結灌腸液治療EMs藥效機制，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、藥物反應、凋亡過程的負調控等生物過程；細胞核、細胞質等重要的細胞組分；蛋白結合、酶結合、轉錄因子結合等分子功能。KEGG通路富集分析主要通過癌癥、TNF、自噬、HIF-1及PI3K-Akt等信號通路發揮藥效機制。其中癌癥相關通路（Path‐ways in cancer）不僅涵蓋交集靶標數量最多，且P值也最小，說明此通路與交集靶點集合顯著相關，進一步通過KEGG Mapper工具對通路圖進行標記，可見交集靶點廣泛分布于整個通路的進程，再次印證EMs所表現的惡性腫瘤的生物學特性仍是研究的重點。

綜上，治療EMs的化瘀散結灌腸液活性成分包括β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、菜油甾醇等，活性成分靶基因主要有PGR、NCOA2、PTCS2、SCN5A等，治療EMs的化瘀散結灌腸液重要靶基因主要有STAT3、JUN、TP53等基因，相關通路主要有癌癥、TNF、自噬等信號通路。本研究運用現代信息技術，將隱性的知識顯性化，系統挖掘化瘀散結灌腸液治療EMs的作用靶點及潛在作用機制，為深入闡釋化瘀散結灌腸液治療EMs的臨床研究及進一步實驗驗證提供了思路。但基于網絡藥理學技術本身的局限性等多方面因素，得出的結論有待后續臨床及實驗的進一步驗證與完善。