食管鱗癌發生發展相關miRNA的篩選及其靶向mRNA生物學功能分析

賈晨飛，陳恩立，宋惠玲，司華蕊，王娟

1河北省人民醫院，石家莊050051；2石家莊市人民醫院

食管癌屬于原發于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國的發病率和病死率均位居前列［1］，由于其早期臨床特征不明顯，很多患者確診時已是中晚期。即便進行標準的同步放化療序貫手術切除后，仍有較高的復發和轉移率，5年生存率不足30%［2］。目前食管癌發生發展的分子機制還不清楚。miRNA是一種小分子非編碼RNA，作用于mRNA的降解或抑制從而影響基因表達［3］，多項研究表明其可能參與了腫瘤的發生發展，是一種具有廣闊前景的生物標記物，但與食管癌發生發展相關miRNA的研究少見，2020年10—12月，我們通過下載GEO數據庫中食管鱗癌與正常組織的miRNA和mRNA表達譜芯片，構建miR‐NA-mRNA調控網絡，尋找食管癌發生發展的相關分子標記物，為其分子機制的闡明提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 食管鱗癌相關基因芯片來源GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。共下載兩張組織芯片（GSE75241、GSE114110）。GSE75241為mRNA表達數據，包括15個食管鱗癌樣本和15個配對正常食管黏膜組織樣本，檢測平臺為GPL5175。GSE114110為miRNA表達數據，包括30個食管鱗癌樣本和10個正常組織樣本，檢測平臺為GPL5175。

1.2 食管鱗癌組織芯片中差異表達miRNA及差異表達mRNA的篩選通過與正常食管黏膜組織標本相比較，利用R語言limma函數包篩選出食管鱗癌組織樣本中差異表達的mRNAs和miRNAs。篩選閾值為P＜0.05和|log2FC|＞2（logFC＞0表示上調差異表達基因，logFC＜0表示下調差異表達基因）。

1.3 食管鱗癌組織樣本miRNA-mRNA調控網絡的構建利用FunRich3.1.3軟件預測食管鱗癌組織樣本差異表達miRNA調控的mRNA，剔除非差異表達mRNA，之后利用Cytoscape軟件構建miR‐NA-mRNA調控網絡圖，并且篩選出節點度值為4～8的miRNA（節點度大的RNA為調控網絡中參與miRNA-mRNA關系對較多的RNA）。

1.4 miRNA-mRNA調控網絡中mRNA生物學功能分析利用DAVID在線工具（https：//david.ncifcrf.gov）對調控網絡中的mRNA進行基因本體論分析（GO富集）和京都基因與基因組百科全書分析（KEGG通路分析），篩選標準為P＜0.05。其中GO富集包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分。

2 結果

2.1 食管鱗癌組織中差異表達的miRNAs與正常食管黏膜組織標本相比，食管鱗癌組織樣本中差異表達miRNAs有114個，其中42個表達下調、72個表達上調；差異表達mRNAs 224個，其中124個表達上調、100個表達下調。（見表1-2）。

表1 食管鱗癌組織樣本中差異表達的前30個miRNAs

2.2 食管鱗癌組織樣本中差異表達miRNA-mRNA調控網絡食管鱗癌組織樣本中差異mRNA和差異miRNA共同參與的miRNA-mRNA關系對66個，其中具有較高節點度的miRNA為hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-143-3p，mRNA為HAS2、ITGA6、COL1A1等（節點度范圍4～8），見圖1。

表2 食管鱗癌組織樣本中差異表達明顯的前30個mRNAs

2.3 miRNA-mRNA調控網絡中mRNA的生物學功能miRNA-mRNA調控網絡中的mRNAs富集于211個GO terms，包 括177個BP、19個CC和15個MF。主要富集在細胞外基質、成骨作用、維生素應答、血小板α顆粒等生物學功能。另外富集在ECM-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、TGF-β等13條通路中。

3 討論

圖1 食管鱗癌組織樣本miRNA-mRNA調控網絡圖（三角形代表miRNA，圓形代表mRNA）

miRNA是一種小分子非編碼RNA，具有多個生物學功能，近年研究表明，其可能在基因表達的全過程發揮作用，在腫瘤細胞侵襲轉移中也起關鍵作用，但不同的遺傳背景和細胞狀態都會影響miRNA對腫瘤細胞運動的調控。Hsa-miR-92b通過直接抑制p57蛋白的表達對胚胎干細胞G1期實現調控，已有Hsa-miR-92b在神經系統腫瘤、淋巴瘤、非小細胞肺癌、肝癌、食管癌等惡性腫瘤中影響細胞增殖的報道［4］。MA等［5］發現，不伴有淋巴結轉移的食管癌樣本中Hsa-miR-92b高表達，且預后好。本研究中Hsa-miR-92b是miRNA-mRNA調控網絡中節點度最高的miRNA，與癌旁組織相比，其表達顯著下調，說明在抑制食管癌侵襲轉移過程中起著關鍵作用。

本研究結果還顯示hsa-miR-195-5p、hsa-miR-143-3p可能參與了食管鱗癌的發生發展。miR-195隸屬miR-15/107miRNA家族，目前已知在惡性腫瘤、心力衰竭和精神分裂癥等多種疾病中被誘導和激活。其通過靶向于多種蛋白的mRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子，在包括消化系統腫瘤、生殖系統腫瘤、骨腫瘤等多種腫瘤中發揮作用。已有文獻表明，miR195在口腔鱗癌組織中表達低于正常組織，其因對CDC42（已被證明在多種人類癌癥中過表達）的抑制實現抗增殖和抗侵襲作用［6］。本研究結果顯示，食管癌樣本中miRNA-195表達下調，提示其在食管癌中也可能發揮相同作用。SUN等［7］認為，miR-195/CDC42的聯合表達比兩者單獨表達更有利于作為預后標記。miR-195的行為機制十分復雜，參與包括Rb-E2F、PI3K/AKT、MAPK/REK在內的多種信號通路，雖然其在腫瘤發生發展復雜機制中作用的研究還處在早期階段，但作為食管鱗癌患者生物標記物的潛力值得期待。hsa-miR-143是多種癌癥的抑瘤因子，包括miR143-3p和miR143-5p兩種亞型，其中miR-143-3p是最著名的抑癌miRNA之一，在乳腺癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌等多種癌癥中均有下調。有研究認為，HOTAIR通過抑制miR-143和miR-125來下調HK2［8］，從而增強了食管癌細胞的侵襲性和遷移，本研究結果與文獻報道一致。

透明質酸（HA）是ECM的重要組成部分，在腫瘤發生的各個階段（包括腫瘤起始、轉移以及化療耐藥性的獲得）都是關鍵因素［9］。HAS2 mRNA的表達與HA的產生密切相關，已有研究證明，HAS2表達的增加與乳腺癌、子宮內膜癌和星形細胞瘤的進展和轉移相關，其不僅在HA代謝和信號通路中起協調作用，而且在miRNAs的作用中還起一系列其他通路的作用［10］。本研究結果顯示，食管鱗癌樣本中HAS2作為表達上調的差異mRNA，在miRNA-mRNA調控網絡中節點度較高，表示HAS2可能在食管鱗癌的增殖、轉移中起到了促進作用。整合素α6（ITGA6）常被用于識別各種組織中的癌癥干細胞群體，它是一種主要的層粘連蛋白受體，研究證明其在胰臟癌、乳腺癌和食管癌中可增強細胞增殖和侵襲能力［11］。本研究結果顯示，食管鱗癌樣本中ITGA6表達顯著上調，這與既往研究一致。值得一提的是，ITGA6是與細胞外配體相互結合的細胞表面受體［12］，基于這種特性，其具有良好的藥理學前景，另外，Hsa-miR-92b可直接錨定于ITGA6［5］，說明調節Hsa-miR-92b有可能可以治療食管癌。

細胞外基質由基底膜和細胞間基質構成，是復雜的大分子網絡，主要成分是糖胺聚糖、蛋白聚糖和和纖維蛋白等［13］。細胞外基質的降解是惡性腫瘤侵襲與轉移不可或缺的環節，基質金屬蛋白酶（MMPs）是目前發現這一環節最重要的酶類，研究表明有淋巴結轉移的食管癌患者中MMP-9蛋白表達高于對照組［14］。另外MMPs也具有促進腫瘤血管生長的作用。本研究結果顯示，調控網絡中差異mRNA主要富集在細胞外基質的成分構成、參與受體間相互作用的通路、腫瘤相關蛋白聚糖通路等，證明細胞外基質與食管癌發生發展密切相關。除此之外，差異表達的mRNA還富集在多條與腫瘤生長相關的信號通路中，如PI3K-AKT、TGF-β。PI3K-AKT通路已成為人類癌癥最常激活的通路之一，靶向于PI3K和AKT的特異性抑制劑治療腫瘤已成為現實［15］。提示PI3K-AKT通路的異常激活參與了食管鱗癌的生長過程。TGF-β是免疫耐受性的關鍵因素，它能抑制免疫系統許多成分的活性和功能，參與腫瘤微環境免疫抑制，并促進腫瘤的生長，還有文獻認為其與免疫治療不良反應有關［16］，根據本研究結果，這條通路也與食管鱗癌的發生發展有關。

綜上所述，食管鱗癌發生發展相關miRNA有hsa-miR-195-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-127-3p，靶向mRNA主要有細胞外基質、成骨作用等生物學功能，參與的信號通路有ECM-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、TGF-β等通路。