HPLC法測定蒙成藥三子散中沒食子酸的含量

王思文,娜仁圖雅,籍學偉*

(1.呼和浩特市食品藥品檢驗所，內蒙古自治區 呼和浩特 010000；2.內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古自治區 呼和浩特 010020)

蒙醫藥作為傳統醫藥重要組成部分，千百年來為守護蒙古族人民的身體健康作出了重要貢獻，蒙醫藥也以其獨特的療效越來越被大家所關注。 三子散[1]作為傳統蒙醫成方制劑便是其中之一，本方是由訶子、川楝子、梔子三味藥材制成，收載于《中國藥典》2015年版一部，具有清熱涼血和解毒的藥理作用，可用于溫熱、血熱、新久熱。訶子作為方中主要藥味，其性苦，酸，澀，平，歸肺、大腸經，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽、強身健體、增強脾胃消化等功效[2]。據文獻報道，訶子中化學成分較為豐富，主要包括酚酸類、鞣質類、三萜類、黃酮類等[3]。本次試驗采用高效液相色譜法以訶子中沒食子酸為指標性成分建立了三子散含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

島津LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PL-203梅特勒-托利多電子天平(千分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Mettler AE-100型電子天平(萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius ME 5型電子天平(百萬分之一，賽多利斯儀器有限公司)。

三子散(烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號190630；內蒙古蒙藥股份有限公司，批號2001043、2002029、1907055、1907056；內蒙古庫倫蒙藥有限公司，批號191251、190706、180444)。

沒食子酸對照品(批號110831-201906)，購自中國食品藥品檢定研究院；模擬樣品為自制；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：10μL；檢測波長：273nm。

2.2 對照品溶液的制備

取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含70μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取三子散約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率300W ，頻率40kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例及制備工藝制成不含訶子的陰性樣品，照“2.3”項下方法制備缺訶子的陰性對照溶液，即得。

2.5 專屬性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，分別按“2.1色譜條件”進樣并記錄色譜圖。供試品呈現與對照品保留時間相同的色譜峰，陰性對照在相應位置無色譜峰。色譜圖見圖1。

A.對照品 B.供試品 C.陰性對照品

2.6 線性關系的考察

取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度為0.7mg/mL的對照品儲備溶液。分別精密吸取上述儲備液0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標，進行回歸分析。結果表明：沒食子酸在6.357μg～158.935μg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=31624x+14985，R=0.999。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品(批號2001043)并于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24h測定含量以考察溶液的穩定性。結果顯示，在不同時間點測得沒食子酸峰面積的RSD為0.15%。表明供試品溶液在24h內穩定。

2.8 精密度試驗

取同一供試品溶液(批號2001043)，連續進樣6次，測定沒食子酸峰面積積分值。結果沒食子酸峰面積的RSD為0.45%。表明儀器精密度良好。

2.9 重復性試驗

取同一供試品(批號2001043)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算沒食子酸的含量。沒食子酸的平均含量為3.14mg/g，RSD為1.18%。表明方法的重復性好。

2.10 加樣回收試驗

取已知含量的供試品(批號2001043)6份，每份約0.25g，精密稱定，分別置6個具塞錐形瓶中。精密加入濃度為80.2μg/mL的沒食子酸對照品溶液10mL(相當于供試品含有量的100%)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1” 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果沒食子酸的平均加樣回收率(n=6)為97.70%，RSD為1.30%。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.11 供試品測定

取8批樣品，各約0.5g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1” 項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算沒食子酸的含量，結果見表2。

表2 供試品含量測定結果

本次研究按照擬定的方法對三家生產企業共8批次樣品進行了含量測定。結果顯示，不同廠家產品的沒食子酸含量之間有差異。此外，同一家生產企業同一年度內生產的樣品，其含量測定結果相對穩定；不同年度生產的樣品，測定結果存在一定的差異。分析原因可能是不同生產企業使用了不同來源的訶子藥材使得含量有所差異，具體原因有待進一步考察研究。

3 討論

3.1 流動相的選擇

參照標準“那如三味丸”項下的含量測定方法[5]，以甲醇-0.1%磷酸溶液(2∶98)為流動相進行測定。根據《中國藥典》2015年版四部通則“高效液相色譜法”項下規定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般不低于5%，否則易導致柱效下降、色譜系統不穩定[6]。在測定過程中，考察了流動相甲醇-0.1%磷酸溶液比例(8∶92)和(5∶95)，結果表明以甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)作流動相時色譜分離效果更好[7-10]。因此，選擇了甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)為流動相。

3.2 提取溶劑及方法的選擇

試驗分別采用50%甲醇、75%甲醇、甲醇作為提取溶劑，考察提取效果，結果表明，用50%甲醇提取的效果最佳；試驗對回流提取、超聲提取和振搖提取進行了比較，結果表明，回流提取與超聲提取效率高且相似。考慮到方法的簡便易行，確定采用超聲提取方法[11-15]。通過對不同提取時間的考察發現，超聲處理30min后，沒食子酸的含量基本不再增加，故確定超聲時間為30min。

3.3 總結

本文采用高效液相色譜法建立了測定三子散中沒食子酸的含量測定方法，該法操作簡便，過程容易控制，重復性、精密度、穩定性、回收率結果均較佳，陰性對照無干擾，可作為進一步提高三子散質量的方法。