骨橋蛋白、環氧化酶-2在宮頸癌組織中的表達及其與化療敏感性的相關性

楊勇波，向 平

宮頸癌是一種發生率較高的婦科惡性腫瘤疾病[1]，新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)則是在實施外科手術切除或放療前進行的適當療程化療，可明顯提高后續外科手術切除或放療的治療效果[2]。雖然NACT治療宮頸癌病人療效顯著，但病人死亡率仍較高，分析原因可能與部分病人化療敏感性差有一定關系[3]。因此在宮頸癌病人實施NACT治療前應準確篩查出這部分病人，有助于醫務人員制定個體化的治療方案，但目前尚缺乏有效的預測性指標[4]。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種機體內廣泛存在的糖蛋白分子，在細胞早期免疫應答反應、惡性腫瘤細胞遠處轉移等起著關鍵性作用。有研究[5]發現，OPN表達與肺癌、惡性膠質瘤周圍組織侵襲、遠處轉移現象及放化療敏感性之間存在密切的聯系，OPN表達水平較高的病人出現放化療抵抗現象的概率更高。環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)則是一種限速酶，其具有促進腫瘤新生血管組織形成、調控細胞增殖凋亡現象、增強腫瘤細胞侵襲和遷移等多種生物學功能，在腫瘤發生及周圍組織侵襲、遠處臟器組織轉移過程中起著關鍵性作用[6-7]。目前OPN、COX-2與宮頸癌化療敏感性的相關性研究較少，因此本研究擬觀察OPN、COX-2在宮頸癌腫瘤病灶組織中的表達水平，并分析兩者與NACT化療敏感性的相關性關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院腫瘤科2017年2月至2019年2月住院期間行NACT治療的157例宮頸癌病人作為研究對象，根據相關腫瘤療效評價標準分為化療敏感組(112例)和化療不敏感組(45例)，2組病人臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。本課題已獲得醫院倫理委員會審核及批準。

表1 2組病人一般臨床資料的比較

1.2 病例納入及排除標準 納入標準：(1)病人入院前未實施外科手術切除或放化療治療；(2)所有病人實施NACT治療前經病理組織檢查均已確診為宮頸癌；(3)病人治療前已知曉研究內容，并簽署自愿參加研究的同意書。排除標準：(1)合并心肝腎等重要臟器功能障礙而無法實施NACT治療的病人；(2)合并有血液、神經等其他系統，或者其他臟器組織惡性腫瘤疾病的病人。

1.3 NACT治療方法 所有病人入院后均實施相同的NACT治療方案(紫杉醇+順鉑，全身靜脈滴注化療)，紫杉醇藥物治療劑量為135 mg/m2，順鉑藥物治療劑量為60 mg/m2，2組病人均治療2個周期，每個治療周期間隔時間為3周，治療期間對出現的各種化療藥物不良反應予以對癥支持治療，密切監測病人的生命體征變化。

1.4 化療敏感評價標準 根據相關腫瘤療效評價標準對病人的化療敏感性予以評估[8]，療效分為完全緩解(CR)：腫瘤病灶組織完全消失，而且淋巴結直徑明顯減小，且減少幅度≤10 mm；部分緩解(PR)：腫瘤病灶組織最長徑之和減少≥30%；疾病進展(PD)：腫瘤病灶組織最長徑之和增大≥20%，而且腫瘤病灶組織須絕對增大>5 mm，或者出現一個以上新腫瘤病灶組織；病情穩定(SD)：腫瘤病灶組織最長徑之和減少<30%，或者腫瘤病灶組織最長徑之和增大<20%。CR和PR病人歸為化療敏感組，PD和SD病人歸為化療不敏感組。

1.5 研究方法

1.5.1 組織樣本采集方法 分別在2組病人NACT治療前及治療結束后3周采用宮頸活檢鉗各取200 mg腫瘤病灶組織。

1.5.2 OPN、COX-2蛋白表達水平檢測 采用Western blotting法檢測2組病人NACT治療前后OPN、COX-2蛋白表達水平，將100 mg宮頸癌腫瘤病灶組織置于1 mL RIPA裂解液中，提取總蛋白并計算蛋白濃度。在99 ℃溫度條件下煮沸作用10 min變性蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后轉入PVDF膜后，使用5%濃度的脫脂奶封閉液封閉處理1 h，稀釋一抗4 ℃溫度條件下孵育過夜作用，采用TBST溶液清洗處理PVDF膜3次，每次5 min，然后二抗室溫條件下孵育處理2 h，采用TBST液清洗處理PVDF膜3次，每次5 min，ECL法顯影處理后采用相應軟件系統分析目的條帶的灰度，以GAPDH為內參蛋白予以比對。

1.5.3 OPN、COX-2 mRNA表達檢測 所有病人NACT治療前后腫瘤病灶組織采用Trizol試劑盒提取總RNA，并逆轉錄生成cDNA，采用RT-PCR法檢測OPN、COX-2 mRNA表達水平，COX-2上游引物為：5′-AGT GAG CGT CAG GAG CA-3′，下游引物為：5′-GTG GGA ACA GCA AGG AT-3′，長度為187 bp，OPN上游引物為：5′-ATG CTA CAG ACG AGG ACA TCA C-3′，下游引物為：5′-CTC ATC ATT GGC TTT CCG CTT A-3′，長度為212 bp，β-actin上游引物為：5′-GGG CTG CTT TTA ACT CTG GTA A-3′，下游引物為：5′-GCT CCT GGA AGA TGG TGA TGG G-3′，長度為180 bp，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-PCR反應體系為：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL，總體積為25 μL。RT-PCR反應程序為：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。整個RT-PCR反應結束后采集相關數據，計算OPN、COX-2 mRNA的相對表達量。

1.5.4 彩超檢測方法 采用三維彩色多普勒超聲檢測2組病人NACT治療前后血管形成指數(vascularization index,VI)、血流指數(flow index,FI)、血管血流指數(vascularization flow index,VFI)等相關參數。

1.6 統計學方法 采用t(或t′)檢驗、Spearman相關分析和logistic回歸法分析。

2 結果

2.1 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2蛋白表達水平比較 化療不敏感組治療前OPN、COX-2 蛋白表達水平明顯高于化療敏感組(P<0.01)，化療不敏感組治療后OPN、COX-2 蛋白表達水平未出現明顯改變(P>0.05)，而化療敏感組治療后OPN、COX-2 蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2蛋白表達水平比較

2.2 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平比較 化療不敏感組治療前OPN、COX-2 mRNA表達水平明顯高于化療敏感組(P<0.01)，化療不敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA表達水平未出現明顯改變(P>0.05)，而化療敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)(見表3)。

表3 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平比較

2.3 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平與超聲相關參數的關系 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平與VI、FI均呈正相關性關系(P<0.05)，而與VFI無明顯相關性關系(P>0.05)(見表4)。

表4 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平與超聲相關參數的關系(r)

2.4 影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析 以化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平及超聲相關參數為自變量，以化療敏感性為因變量進行logistic多因素分析，結果顯示：化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平及VI、FI為化療敏感性的獨立危險因素(P<0.05)(見表5)。

表5 影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析

3 討論

NACT的治療有效率可超過70%,但仍有部分宮頸癌病人對NACT不敏感，不但對后續治療時機造成明顯的延誤，而且還可耗費過多的醫療資源，明顯增加病人的經濟負擔，故準確評估病人對NACT的化療敏感性顯得極為關鍵[9]。目前醫務人員多采用婦科常規檢查、影像學檢查等對宮頸癌病人NACT治療效果予以評估，但準確性易受到較多因素的影響，從而導致誤診、漏診情況發生[10]。由于腫瘤相關標志物與惡性腫瘤疾病發生發展及預后之間存著密切的聯系，不但可用來評估宮頸癌病人NACT的治療效果，還可通過實驗室檢測治療前后表達水平變化而預測宮頸癌病人NACT的化療敏感性[11]。

OPN是一種分泌型糖蛋白，其具有較多生物學功能作用，在促進腫瘤細胞周圍組織浸潤、遠處臟器組織轉移等方面起著關鍵性作用[12]。有研究[13]發現，卵巢癌及交界性卵巢腫瘤病人病灶組織中的OPN表達水平明顯高于正常卵巢組織及良性卵巢組織。還有研究[14-15]證實，OPN可明顯增強宮頸癌細胞的周圍組織侵襲能力，且在宮頸癌組織表達水平明顯升高，同時OPN表達水平與惡性腫瘤細胞的含氧量及放化療敏感性之間存在密切的聯系。COX-2是一種機體內花生四烯酸合成和釋放前列腺素過程中的重要限速酶，一般情況下多數臟器組織呈低水平表達，但在炎癥感染反應、腫瘤疾病發生等因素刺激下可短期內明顯升高[16]。COX-2具有調控細胞增殖凋亡，誘導腫瘤新生血管組織形成，介導細胞之間黏附作用，促進腫瘤細胞免疫逃逸等多種生物學功能，從而在增強腫瘤細胞周圍組織浸潤、遠處臟器組織轉移等方面起著關鍵性作用[17]。有研究[18-19]發現，COX-2表達水平升高可通過多種途徑明顯增強宮頸癌細胞的侵襲能力，使得惡性腫瘤細胞可順利穿透脈管屏障系統，導致腫瘤病灶組織出現直接局部浸潤現象及遠處臟器組織的轉移，并且與宮頸癌病人預后有著密切的聯系。因此推測OPN、COX-2可作為臨床預測宮頸癌病人NACT化療敏感性的實驗室指標。本研究顯示，化療敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達水平較治療前明顯降低(P<0.05)，提示NACT方案中的化療藥物可有效抑制化療敏感組病人宮頸癌組織中OPN、COX-2 mRNA和蛋白的表達，而化療不敏感組治療前后OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示NACT方案中的化療藥物無法有效抑制化療不敏感組病人宮頸癌組織中的OPN、COX-2 mRNA和蛋白的表達。同時本研究還比較了2組病人治療前OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達水平，結果發現化療不敏感組治療前OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達水平明顯高于化療敏感組(P<0.05)，提示NACT治療前檢測OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達水平有助于醫務人員預測宮頸癌病人的化療敏感性。

本研究進一步探討發現，治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平與VI、FI等呈正相關性關系(P<0.05)，而與VFI無明顯相關性關系(P>0.05)，影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析結果顯示，化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達水平及VI、FI為化療敏感性的獨立危險因素，提示宮頸癌組織中的OPN、COX-2表達水平與化療敏感性之間存在密切的聯系，可用于宮頸癌病人NACT治療前化療敏感性的預測，在臨床應用中具有較高的價值。