血清線粒體融合蛋白-2和乙醛脫氫酶2與慢性心力衰竭的相關性研究

張 冰，張 維，胡祥穩，李茂源，湯 陽，盧園園，康品方，張寧汝

慢性心力衰竭(CHF)是心血管疾病常見的晚期改變，是與衰老有關的慢性疾病之一。近年來雖然CHF在治療上有一定的進展，但其發病率及死亡率仍處于上升趨勢[1]。CHF現治療上主要從改變神經激素環境抑制交感神經興奮、腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性來降低心肌重構[2]，從而延緩心力衰竭進展和降低死亡率。目前許多文章報道心血管疾病中的氧化應激會導致線粒體功能受損，導致心肌細胞能量供應不足，影響心肌細胞正常收縮功能，加快心力衰竭進展[3]。線粒體融合蛋白-2(Mfn2)位于線粒體外膜，能調節線粒體融合和分裂的蛋白質，所以對維持線粒體正常功能起著重要作用[4]。同樣乙醛脫氫酶 2(ALDH2)是能夠抑制機體氧化應激，維持正常線粒體功能的關鍵酶，能夠調節心肌細胞凋亡、纖維化來延緩心力衰竭進展[5]。臨床研究中關于Mfn2、ALDH2與CHF病人的相關性研究尚不明確。本文針對Mfn2、ALDH2與CHF病人的相關性研究進行研究，為CHF的診斷及治療探索提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年10月至2019年10月在我院心血管內科入院的CHF病人180例(CHF組)，納入標準：(1)所有病人均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》；(2)所有病程≥3個月；(3)符合美國紐約心臟病協會(NYHA)分級在Ⅱ～Ⅳ級間；(4)臨床資料完整。排除標準：急性ST段抬高型心肌梗死、急性創傷、肺栓塞、縮窄性心包炎、心肌炎，先天性心臟病，瓣膜性心臟病，風濕性心臟病，合并有肝、腎系統損傷、惡性腫瘤等嚴重原發性疾病病人。將收集的CHF病人180例按照NYHA分級標準進行分組，包括Ⅱ級46例，Ⅲ級63例，Ⅳ級71例。另外選取同期在我院門診健康體檢者40名為對照組，均無任何心血管疾病。本次研究已通過我院倫理委員會的審核。所有研究對象均對本次研究知情同意。

1.2 檢測指標 Mfn2、ALDH2水平檢測均采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，試劑盒(ELISA Kit-上海羽朵)。N末端B 型利鈉肽原(NT-proBNP)、白細胞、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、血肌酐等生化標志物和左心室射血分數(LVEF)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)分別在我院檢驗科和心臟超聲室完成。同時收集并比較所有研究對象的一般資料，包括性別、年齡等基本情況。

1.3 統計學方法 采用t(或t′)檢驗、χ2檢驗、方差分析和q檢驗，Pearson相關性分析，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析進行診斷實驗的評價。

2 結果

2.1 2組研究對象基線資料比較 2組研究對象的性別、年齡、天門冬氨酸氨基轉移酶、三酰甘油等生化標志比較差異均無統計學意義(P>0.05);CHF組白細胞水平高于對照組,丙氨酸氨基轉移酶和血肌酐低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 2組病人一般資料比較

2.2 2組研究對象的血清Mfn2、ALDH2 及相關指標比較 與對照組比較，Mfn2、ALDH2、LVEF在CHF組中降低，NT-proBNP、LVEDD在CHF組中增高，差異均有統計學意義(P<0.01)。CHF心功能Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級病人組間比較，Mfn2、ALDH2隨著心功能降低而降低，NT-proBNP、LVEDD逐級增高，差異均有統計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 2組研究對象的血清Mfn2、ALDH2水平及相關指標比較

2.3 LVEF下降和保留的CHF病人的各項檢測指標比較 CHF組中，LVEF≤40%病人為72例，LVEF>40%病人為108例;LVEF≤40%病人組Mfn2、ALDH2低于LVEF>40%病人，NT-proBNP、LVEDD高于LVEF>40%病人，差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(表 3)。

表3 LVEF下降和保留的CHF病人的各項檢測指標比較

2.4 CHF病人血清Mfn2、ALDH2水平與相關指標的相關性分析 經Pearson相關分析，CHF組中，Mfn2與LVEDD呈負相關(P<0.01)，與LVEF呈正相關(P<0.01)，與NT-proBNP無相關性；ALDH2與LVEF呈正相關(P<0.01)，與NT-proBNP 、LVEDD無相關性(見表4)。

表4 Mfn2、ALDH2與NT-proBNP、LVEFLVEF和LVEDD的相關性分析

2.5 Mfn2、ALDH2診斷CHF ROC曲線 通過 ROC 曲線分析，ALDH2診斷CHF的 ROC曲線下面積為0.831，95%CI為 0.762～0.900(P<0.05),當ALDH2取值 48.710 U/L時，敏感度為 1.00，特異度為 1.00。Mfn2診斷CHF的ROC曲線下面積為0.803，95%CI為0.719～0.887(P<0.05),當Mfn2取值2.377 ng/mL 時，敏感度為1.00，特異度為1.00。將Mfn2、ALDH2兩者聯合起來診斷得到預測概率，其診斷CHF的ROC曲線下面積為0.891，95%CI為0.823～0.958(P<0.05)(見圖 1)。

3 討論

CHF是一種頑固性疾病，近年來死亡率和發病率都在穩步上升，在世界范圍內伴隨著巨大的經濟損失[6]。在心力衰竭發病機制中心肌細胞凋亡、心室重構起著至關重要的作用。目前研究機制發現心肌細胞的能量供應不足及利用障礙會使存活心肌儲備減少，進一步心室收縮功能減退，進而發展或加重心力衰竭[7]。大約有三分之一的心肌細胞具有線粒體用于提供心肌收縮功能所需ATP，因此線粒體在心肌細胞生長和心肌細胞正常功能上起著至關重要的作用[7]。有研究[7]發現Mfn2、ALDH2能通過抑制氧化應激來保護線粒體，完成心肌細胞正常能量供應。此外還能通過調節自噬等方面減少細胞凋亡，以及抑制心肌重構來延緩心力衰竭進展[8-9]。本次試驗中在對照組中Mfn2、ALDH2水平高于CHF組，且隨著CHF心功能減退，Mfn2、ALDH2逐漸降低，所以Mfn2、ALDH2可能參與慢性心力衰竭的發生及發展。

Mfn2通過介導融合蛋白和分裂蛋白的平衡，參與線粒體形態和功能的調控，維持正常線粒體正常功能[10]。SEIDLMAYER等[1]在Mfn2基因敲除小鼠中發現其不能通過IP3介導線粒體在生理條件下維持心肌細胞ATP水平。張磊[11]在KLF9敲除的小鼠中發現Mfn2水平降低，心肌線粒體形態異常及功能也降低，不能合成足夠的ATP維持心肌正常收縮功能，隨著小鼠心室腔變大，心力衰竭逐漸發生。Mfn2可以通過調節AKt 信號通路和Ca2+途徑調節心肌細胞凋亡。當Mfn2降低時會使Akt磷酸化降低，Bcl家族中的Bax表達增多，激活capase-3促進心肌細胞凋亡，存活心肌細胞丟失逐漸導致心力衰竭發展及加重[12]。Mfn2還參與介導Ca2+從線粒體外膜釋放到細胞基質過程，當Mfn2表達缺陷可引起Ca2+轉運異常來促進心肌細胞凋亡[13]。HU等[14]對糖尿病心肌病的小鼠進行Mfn2的重組發現心功能LVEF和左心室縮短率的增加。同樣在心肌重構方面，YU等[15]在體外培養的心肌細胞經血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ)處理后，Mfn2基因表達受到抑制，會使心肌肥厚和蛋白質合成增加，從而加重心肌重構發生。本次研究中我們發現隨著心功能分級增加，Mfn2水平逐步降低，特別在心功能Ⅱ級與Ⅳ級之間有統計學意義(P<0.05)。在CHF中隨著LVEF降低，Mfn2水平也減少，且Mfn2與LVEDD呈負相關，與LVEF呈正相關。Mfn2在延緩心力衰竭進展可能起到積極作用，但在維持線粒體正常功能、減少心肌細胞凋亡等方面作用仍需進一步論證。

ALDH2是一種非細胞色素P450線粒體醛氧化酶[16]，能夠抑制氧化應激時活性氧(ROS)的生成，以及對氧化應激時的產物醛有解毒作用，減少對線粒體損害，維持線粒體正常形態和能量供應[17]。谷小雨[18]用體外培養心室肌細胞在ALDH2激動劑劑組中發現ROS 釋放水平及細胞凋亡率均明顯降低，證實ALDH2在減少心肌細胞凋亡中有保護意義。此外ALDH2也通過調節自噬功能，自噬心肌細胞凋亡時產生的異常蛋白的沉積，減輕心室壁僵硬度，減輕心肌纖維化，維持心室正常彈性力和收縮功能[19]。LI等[3]在ALDH2敲除的小鼠中發現心肌纖維化和心功能障礙加重，同時在8周時LVEF低于正常值。ALDH2在調節線粒體功能外，還可增強心肌細胞對內質網應激誘導的細胞毒性和凋亡的抵抗，減少細胞凋亡[20]。胡藝川[21]在使用ALDH2抑制發現心肌細胞ROS 水平的增加，同時誘導的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導途徑的活化，促進心肌細胞凋亡。在心肌重構方面，ALDH2可通過P38MAP通路降低心臟局部AngⅡ水平來減輕心肌細胞重構，保障正常心肌收縮功能[22]。正如HUA等[17]用ALDH2激動劑處理心肌梗死后的CHF大鼠中發現能夠明顯提高心臟LVEF值。本次研究發現在對照組中ALDH2高于CHF組，且隨著CHF心功能減退，ALDH2水平逐漸降低。在LVEF≤40%的CHF組中ALDH2水平低于LVEF>40%，且與LVEF呈正相關。說明ALDH2在心力衰竭進展可能起到積極保護意義，特別在抑制氧化應激來減少心肌細胞凋亡方面有獨特的價值，但需要今后更多臨床實踐論證。

目前在心力衰竭診斷方面，BNP 及 NT-proBNP 從心臟壓力負荷方面反應心力衰竭嚴重程度及預后評估指標，同時可溶性ST2、半乳糖凝集素3從心肌纖維化、炎癥方面反映心力衰竭程度[23]。本次研究中ALDH2、Mfn2診斷CHF的 ROC 曲線下面積均>0.8，ALDH2、Mfn2與CHF的發生及發展有一定關系，故ALDH2、Mfn2可從氧化應激、細胞凋亡方面對CHF進行診斷及預后評估。

綜上所述，本次實驗中血清Mfn2、ALDH2水平在CHF病人中降低，并隨著心功能減退而減低，說明Mfn2、ALDH2在CHF發生及發展中可能發揮一定保護作用。雖目前有研究指出Mfn2、ALDH2可通過調節線粒體功能受損、減少心肌細胞凋亡、抑制心肌細胞肥厚等方面延緩心力衰竭進展，但具體作用機制仍需大量臨床實驗。