黃連堿促進肝細胞自噬及膽固醇外流改善脂肪肝的脂質蓄積

沈敏燕,胡 曦,朱 靜,張光亞,毛子明,陳鳳玲

肝臟是人體重要器官，它參與物質的代謝和能量的吸收、存儲，同時可保護人體免受藥物和各類毒物損害，脂肪肝是一種由于肝細胞內過量脂質蓄積而引起的肝臟病變。其中非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver，NAFLD)最為常見，隨著NAFLD的患病率不斷升高和患病人口年輕化，NAFLD已成為危害我國國民健康的主要疾病之一[1]。而NAFLD是一種可逆性疾病，通過早期發現與干預治療可恢復正常，如通過運動、控制飲食、降脂藥物等都可以緩解NAFLD的發生發展。自噬是一種真核細胞中特有的保護細胞內環境穩態的機制，它可以通過溶酶體對細胞內物質降解再利用。而自噬可依賴溶酶體釋放的酸性脂肪酶將胞內脂質進行降解排出胞外，這一過程被稱為“脂噬”[2-3]，當細胞中的自噬功能出現異常，細胞正常的新陳代謝受到影響，進而影響細胞存活。研究[4-5]結果表明，自噬對于肥胖、NAFLD、冠心病、動脈粥樣硬化等代謝綜合征有著積極的調控作用。黃連堿(coptisine，COP)是中藥黃連提取物的一種，與小檗堿同屬于異喹啉類生物堿的中藥活性成分，文獻[6]報道，小檗堿在肥胖小鼠具有調節血脂以及降膽固醇的作用，小檗堿也可通過細胞中線粒體活動上調AMP和ADP的含量激活AMPK，進而調節脂質的氧化應激反應起到降脂的作用。而COP相較于小檗堿更具有細胞親和性，COP是否與小檗堿同樣具有降脂作用及其機制尚未有明確報道[6-8]。本課題將在細胞實驗水平上探索COP是否調控肝細胞的脂肪變性。現作報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HepG2 細胞(中科院上海細胞庫)，COP(Sigama)，牛血清(Sigma Aldrich),RIPA 裂解液(上海元象生物公司)，loading buffer緩沖液(上海碧云天公司)，MEM低糖培養基(Sigma Aldrich)，β-actin 抗體(Abcam 公司)，細胞微管相關蛋白1 輕鏈3(LC3Ⅰ/Ⅱ)抗體、ATG5 抗體(Cell Signaling 公司)，油紅O(基科生物)，

1.2 細胞培養與分組 通過含10%FBS的MEM低葡萄糖培養基中培養HepG2并在對數期收獲細胞進行后續實驗分組。將HepG2 細胞根據是否用棕櫚酸、油酸和COP處理進行分組，分為 4 組，分別為對照組、FFA組(棕櫚酸、油酸誘導HepG2細胞24 h形成脂肪肝細胞模型組)，COP+HepG2組(COP處理HepG2細胞24 h)以及COP+FFA組(COP+FFA，用COP將HepG2預處理2 h后再用油酸和棕櫚酸誘導)。

1.3 構建脂肪肝細胞模型 用無血清的MEM液體培養基稀釋至細胞濃度為5×105個/毫升備用，接種入6孔板中，加入50 μmol/L的棕櫚酸與100 μmol/L的油酸共同誘導24 h后，使HepG2細胞脂肪變性形成脂肪肝細胞模型。

1.4 CCK8檢測COP對細胞增殖活性的影響 用不同濃度的COP(0、5、15、25、35 μmol/L)對HepG2細胞處理24 h，再進行CCK8細胞活性檢測。

1.5 油紅O染色檢測各組細胞間脂質蓄積的變化 用12孔板培養細胞，培養前，置入爬片(已消毒)。按照分組，分別對細胞進行相應的處理，按照實驗要求對細胞進行培育，PBS清洗細胞2～3次，接著用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 清洗殘余的多聚甲醛；使用60%的異丙醇分化細胞1 min，PBS繼續清洗殘余異丙醇，加入油紅O工作液(避光搖床染色30min)，PBS沖洗爬片3次(每次2 min)；蘇木素染色40 s，最后ddH2O沖洗，用甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞狀態并采集圖像。

1.6 RT-PCR檢測各組細胞中自噬基因和膽固醇流出介導基因mRNA水平的表達變化 細胞均培養在 6 孔細胞培養板中，當細胞密度達 80%～90%時收細胞，用Trizol法抽提總RNA，DEPC水溶解RNA沉淀，4 ℃過夜后在Nanodrop 測定其純度及濃度，在冰上完成RNA逆轉錄為cDNA的操作，采用熒光定量PCR,設3個復孔，配置總的孔數所需溶液，每孔包含5 μL Mix、2 μL DEPC水、1 μL cDNA、1 μL 引物正義鏈、1 μL cDNA 引物反義鏈(見表1)。

表1 引物序列

1.7 Western blotting檢測各組細胞自噬相關基因和膽固醇流出介導基因在蛋白水平的表達變化 細胞培養于6孔板中，待細胞密度達到80%～90%時收細胞，用PBS清洗細胞，按照RIPA∶PMSF∶蛋白酶抑制劑∶磷酸抑制劑=100∶1∶1∶1的比例配置蛋白裂解液，裂解細胞，得到的蛋白上清液加1×loading buffer混合后95 ℃水浴10 min，加樣，跑電泳(80 V 30 min，120 V 1 h)，轉膜(300 mA 2 h或1 h)，室溫搖床封閉PVDF膜1 h，加入LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5、ABCA1抗體 4 ℃冷庫孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫下搖床加二抗孵育1 h，TBST再洗膜3次,加化學發光液(A液∶B液=1∶1配制)于PVDF膜顯影，采用化學發光顯影儀顯像，之后用Image J進行灰度定量分析。

1.8 統計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度的COP對HepG2細胞增殖活性的影響 相較于對照組，5～25 μmol/L的COP處理細胞時，HepG2細胞活性無明顯變化，而35 μmol/L的COP處理HepG2細胞,細胞活性明顯降低(P<0.05)(見表2)，說明COP對HepG2有藥物劑量效應，0～25 μmol/L的COP對HepG2細胞活性無明顯影響，因此選25 μmol/L的COP為藥物干預實驗濃度。

2.2 油紅O染色結果顯示 顯微鏡下可觀察到相較于對照組，FFA組細胞內脂滴(油紅O染色陽性)明顯增多，COP+FFA組中油紅O染色陽性細胞數明顯減少，說明COP可減少脂肪肝細胞內脂質的蓄積(見圖1)。

2.3 RT-PCR結果顯示 在mRNA水平，相較于對照組，FFA組自噬相關蛋白與膽固醇外流介導蛋白的表達量顯著下調；而相較于FFA組，COP+FFA組中的自噬與膽固醇外流的基因表達又明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表3)，說明棕櫚酸與油酸可抑制HepG2細胞的自噬和膽固醇外流，而COP能夠改善脂肪肝細胞的自噬障礙與膽固醇外流障礙。

表3 各組細胞中自噬相關蛋白 LC3Ⅰ/Ⅱ和 ATG5及膽固醇流出蛋白ABCA1在mRNA水平表達的變化

2.4 Western blotting結果顯示 在蛋白表達水平，與對照組比較，COP+HepG2組的自噬相關蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5和膽固醇外流介導蛋白ABCA1表達量明顯增多，而FFA組的自噬相關蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5和膽固醇外流介導蛋白ABCA1明顯降低；而在COP+FFA組細胞中，與FFA組比較，自噬和膽固醇外流相關蛋白的表達水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表4)。

表4 各組細胞中自噬相關蛋白 LC3Ⅰ/Ⅱ和 ATG5及膽固醇流出蛋白ABCA1在蛋白水平表達的變化

3 討論

NAFLD是一種多種病因引起的以肝細胞彌漫性脂肪病變為特征的代謝疾病。NAFLD如未得到控制，可能向脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化發展，甚至惡化為肝細胞癌[9]。NAFLD的發病機制較為復雜，較為認可的學說是“二次打擊”學說，即NAFLD的發生與發展需要經過兩個階段：“第一次打擊”是由于機體發生胰島素抵抗導致肝細胞功能異常，肝臟中脂質過度蓄積；細胞脂噬和膽固醇外流可抑制“第一次打擊”中的肝臟脂質沉積；“第二次打擊”是在脂質蓄積的基礎上，活性氧刺激肝細胞會誘發氧化應激反應導致肝臟炎癥和纖維化，促使NAFLD向脂肪性肝炎發展[10]。

在生理狀態下，自噬水平較低，在饑餓、低氧等應激條件下，自噬能自發啟動，為維持細胞穩態提供所需的底物；同時自噬可降解細胞內脂質、糖類、非折疊蛋白等。目前絕大多數的對于自噬與NAFLD的探究結果表明，自噬可以促進肝細胞中脂質降解，減少肝臟的脂質沉積，研究[11]發現在肥胖小鼠中存在胰島素抵抗現象，肝臟脂肪變性明顯，而小鼠肝臟細胞中自噬相關基因ATG7 的表達降低，自噬過程受到抑制，通過上調肝細胞自噬基因ATG7的表達，細胞自噬功能恢復，觀察到小鼠的胰島素抵抗現象也會得到改善，進而減少小鼠的肝臟脂肪蓄積。由此可說明激活肝細胞中的自噬過程可改善肝臟脂肪病變。而自噬受許多蛋白調控，其中ATG5出現在囊泡延伸并參與了自噬全程；在自噬泡形成過程中存在的一種關鍵蛋白LC3，以2種形式存在于細胞中，即LC3-Ⅰ和其蛋白水解衍生物LC3Ⅱ,LC3Ⅱ的表達增加意味著細胞自噬活躍[12]。在肝細胞中ABCA1和高爾基復合體的通路是膽固醇流出最主要的途徑，由載脂蛋白A-Ⅰ運載膽固醇至高密度脂蛋白膽固醇隨血液循環進入機體再循環[13-14]。近年來，對于中藥活性物質的深入研究，發現多種中藥活性成分可調控細胞自噬和細胞內其他代謝途徑間接影響脂質代謝的過程[15-16]；COP是藥材黃連的主要活性成分之一，其具有多種藥理作用，可改善細胞自噬、線粒體活動、氧化應激等，COP的同源生物小檗堿已被證實對脂肪肝有抑制作用[8]。

在本研究中，HepG2細胞在經過50 μmol/L棕櫚酸和100 μmol/L油酸處理24 h后誘導形成脂肪肝細胞模型，采用油紅O染色檢測，FFA組細胞內有大量脂滴形成，說明脂肪肝細胞模型構建成功，經過25 μmol/L的COP預處理的COP+FFA組細胞中脂滴明顯減少，說明COP可改善脂肪肝細胞中的脂質蓄積。通過RT-PCR和Western blotting結果顯示，在COP+HepG2組細胞中，其自噬基因的表達明顯升高；在FFA組細胞中，自噬基因ATG5、LC3Ⅰ/Ⅱ和膽固醇外流蛋白ABCA1的表達水平明顯下降，說明肝細胞脂肪蓄積的情況下，可造成細胞自噬障礙和抑制細胞膽固醇外流；在COP+FFA組細胞中，其自噬和膽固醇外流水平明顯升高，這說明了COP可改善肝細胞中脂質蓄積造成的自噬障礙，同時還可通過上調ABCA1的表達促進細胞中膽固醇外流。由此我們可推測COP可能通過調控細胞自噬和膽固醇外流來改善肝臟細胞的脂質蓄積。

研究結果表明,HepG2細胞經棕櫚酸和油酸處理后會抑制細胞自噬和膽固醇外流，而COP能修復細胞自噬障礙和膽固醇外流抑制，同時減少了肝細胞內脂質蓄積，進而可能減少脂肪肝細胞的形成。本文可以為日后臨床上使用COP治療NAFLD提供相關理論基礎。