先天性心臟病基礎研究進展

艾珊珊，何愛彬

1南方醫科大學基礎醫學院生理教研室， 廣州 510515 2北京大學分子醫學研究所， 北京 100871

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是指胚胎期心臟和大血管發育異常所致的畸形，包括心臟壁、瓣膜及血管畸形。CHD作為最常見的人類出生畸形，其患病率約為0.8%～1.2%[1]。2019年，

一項系統綜述分析了全球1970—2017年新生兒CHD的患病情況，其中以室間隔缺損(ventricular septal defect,VSD)和房間隔缺損(atrial septal defect,ASD)比率最高(圖1)。由于成年哺乳動物的心臟缺乏再生能力，其受損后無法恢復正常，因此CHD具有極高的發病率和致死率[2]。近年來，雖然科學家對CHD的發病機制進行了深入研究和探討，但由于其致病機制復雜，僅20%的CHD致病基因得以鑒定，大部分CHD的發病原因仍無從解釋，這極大限制了CHD臨床治療的開展[3]。因此，加快CHD的基礎研究迫在眉睫。

圖 1 不同類型心臟畸形占先天性心臟病的比率[4]CoA：主動脈縮窄；ASD：房間隔缺損；TOF：法洛四聯癥；TGA：大動脈移位；PDA：動脈導管未閉；PS：肺動脈狹窄；AS：主動脈狹窄；AVSD：房室間隔缺損；HLHS：左心發育不全綜合征；VSD：室間隔缺損

研究表明，導致CHD的突變基因多在心臟早期發育過程中發揮重要調控作用，包括心臟轉錄因子、心臟特異基因或某些信號通路分子[2]。然而，由于CHD的致病因素復雜，大部分CHD的病因無法僅通過遺傳因素進行解釋，如相同的CHD突變基因在不同患者的心肌組織中可引起不同類型的基因表達異常，相同的CHD致病突變可導致不同類型的心臟畸形。因此，對于CHD致病機制的深入了解，有助于尋找新的預防和治療手段。本文將對CHD的致病因素及探究CHD致病機制的常用研究模型進行闡述，以期為臨床診療提供理論依據。

1 遺傳因素

自1949年Campbell首次報道CHD遺傳因素以來[5]，尋找CHD的遺傳致病基因成為該領域的研究熱點。根據基因突變類型，CHD的遺傳致病因素可分為：點突變、染色體非整倍性、染色體拷貝數變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)等[6]。

點突變通過改變靶基因的轉錄活性或改變蛋白質的功能而導致CHD，如Alagille綜合征是由JAG1基因顯性突變引起[7]。心臟的重要轉錄因子(如NKX2- 5、NKX2- 6、GATA4、GATA5、GATA6、IRX4、TBX20和ZIC3等)突變均可導致CHD[8]。關于CHD點突變的鑒定，最初主要通過家族性病例進行經典連鎖分析，隨著二代測序技術的快速發展，可直接通過高通量測序(包括外顯子測序和全基因組測序)完成CHD點突變的檢測。

除點突變外，CHD的發生常與某些形式染色體的異常相關，包括染色體結構和數目的異常。唐氏綜合征(又稱“21-三體綜合征”)是一種最常見的染色體非整倍體形式，通常與ASD相關。染色體數目異常(非整倍性)同樣可增加CHD的發病率。研究表明，約50%的唐氏綜合征和特納綜合征患者可發展為CHD[9]。對于其他三體性疾病，如18-三體綜合征和13-三體綜合征，CHD的患病率高于50%[10]。此外，在法洛四聯癥、ASD、VSD、主動脈瓣狹窄和心室管腔狹窄的患者中均檢測到大量結構異常的染色體[11]。隊列研究表明，心臟特異基因在重復200 kb或缺失100 kb的情況下均可導致CHD，目前主要通過核型分析診斷染色體數目[11]。

一般而言，CHD患兒的CNV發生率較高。據報道，在某些法洛四聯癥[12]、左心室病變[13]及其他一些散發性CHD新生兒[14]中均存在CNV。因此，鑒定CHD的CNV有助于更好地認識其致病機理。Goldmuntz等[15]利用染色體微陣列(chromosomal micro-array analysis，CMA)技術鑒定了240種不同的CNV，這些基因在心臟發育過程中發揮重要調控作用，包括NRP1、NTRK3、MESP1、ADAM19和HAND1等。隨著測序技術的迅猛發展，高通量二代測序技術正逐漸取代CMA用以鑒定染色體拷貝數的變化。

2 表觀遺傳因素

約20%的CHD由遺傳因素導致，但多數情況下CHD的致病原因無法解釋。越來越多的基礎及臨床研究表明CHD常伴隨表觀遺傳圖譜的改變。因此，深入了解CHD的表觀遺傳致病因素迫在眉睫。

表觀遺傳調控是指在不改變基因組序列的前提下，對基因表達進行調控的一種方式。除某些細胞(如配子細胞和免疫細胞)外，人體細胞都具有相同的基因型，表觀遺傳因素決定這些基因型相同的細胞表現不同的狀態，發揮不同的功能。表觀遺傳調控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑因子、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等。

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調控方式，研究表明CHD患者具有特異的DNA甲基化圖譜[16]，DNA甲基化狀態的改變與CHD的發生存在一定相關性。在DNA中，從5′→ 3′方向上連續的胞嘧啶-鳥嘌呤核苷酸稱為CpG位點，在整個基因組中，CpG含量高的區域稱為“CpG島”。“CpG島”是一段長約300～3000 bp，且不易被甲基化的區域。大約70%的基因啟動子分布在“CpG島”中，因此這些區域的甲基化常與基因表達“沉默”相關。除這種經典的調控方式外，“CpG島”還可位于啟動子之外，其甲基化在某些情況下可促進基因的表達[17]。

在心臟發育過程中，DNA甲基化控制基因的時空特異性表達。某些法洛四聯癥患兒心肌中NKX2.5和HAND2啟動子區域甲基化水平升高，導致NKX2.5和HAND2表達下調[18]。比較CHD患兒(包括主動脈瓣狹窄、法洛四聯癥和VSD)與健康新生兒心肌的DNA甲基化圖譜可發現，ASD/VSD新生兒心肌中存在52個基因的DNA甲基化異常，其中2個與冠狀動脈疾病相關的基因APOA5和PCSK9出現高度甲基化[19]。

2.2 組蛋白修飾

染色體的基本結構單元為核小體，核小體由組蛋白八聚體組成。組蛋白可通過不同類型的共價修飾以改變染色體結構，影響蛋白質與DNA的結合，從而調控基因表達。組蛋白的共價修飾主要包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和磺酰化等。組蛋白修飾可在不改變基因序列的情況下調控心臟轉錄因子的表達量及活性[20]，因此組蛋白修飾紊亂是CHD的重要致病因素。組蛋白修飾的可逆性，使其成為治療CHD的潛在靶點。

2.2.1 組蛋白去乙酰化酶

組蛋白乙酰化修飾通過減弱DNA與組蛋白的相互作用而促進基因表達，與之相反，組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)通過移除組蛋白乙酰化修飾而與基因表達“沉默”相關。研究發現，HDAC5和HDAC9雙敲除的小鼠心肌細胞增殖與成熟受阻，可出現心室壁變薄及致死性VSD表型[21]。最新研究發現，單心室CHD患者的心肌HDAC活性異常增強，證實HDAC表達異常會導致CHD[22]。因此，HDAC抑制劑被用于治療CHD。

2.2.2 多梳蛋白家族

組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化修飾(H3K27me3)是一種廣泛分布的抑制性組蛋白修飾，其主要催化蛋白為多梳蛋白家族的多梳抑制復合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)。PRC2蛋白的異常表達和H3K27me3修飾水平的紊亂均可導致CHD。心肌特異性EZH2(EZH2是PRC2的主要甲基轉移酶)缺失的小鼠可出現VSD、ASD、心內膜墊增厚、上皮-間質轉化受損及心肌細胞凋亡增加等表型[23]。研究發現，左心發育不良綜合征患者的誘導性多能干細胞(induced pluri-potent stem cells，iPSCs)分化的心肌細胞中EZH2表達量下降，且一些重要的心臟發育基因TBX2、HEY2、NOTCH1、NKX2.5和HAND1的表達亦降低[24]。與PRC2作用相反，UTX和JMJD3是2個重要的H3K27me3去甲基化轉移酶，與基因表達激活相關。UTX和JMJD3可上調GATA4的表達，同時UTX可在整個心臟發育過程中維持NKX2.5和TBX5的表達。UTX和JMJD3表達紊亂直接影響GATA4、NKX2.5和TBX5的表達[24- 25]，因此UTX和JMJD3表達失調亦可導致CHD。

2.3 染色質重塑因子

染色質重塑復合物通過調控DNA結合蛋白的活性進而調節心臟的基因表達。BAF(BRG/BRM-associated factor)是一類重要的染色質重塑復合物。研究表明，BAF劑量的微小改變即可導致CHD，如BAF60c表達下調可嚴重影響心臟流出道的發育[26]，BRG1表達紊亂可導致小鼠左心室發育嚴重缺陷[27]。另有研究發現，BAF可與心臟轉錄因子TBX1相互作用，調控右心室發育相關基因Wnt5a表達，TBX1和Wnt5a的表達下調均可導致右心室發育不良[28]。此外，BAF可與某些組織特異性蛋白相互作用，改變特定區域的組蛋白修飾狀態，從而擾亂心肌細胞的基因表達[29]。

2.4 長鏈非編碼RNA

lncRNA是由200多個核苷酸組成的無編碼功能RNA。lncRNA通過參與組蛋白修飾等表觀遺傳調控過程調節基因表達，發揮其生物學作用。研究發現，某些VSD患者的心肌細胞可出現lncRNA表達失調，lncRNA與CHD的發生存在一定的相關性。據報道，孕有CHD胎兒的母體存在lncRNA表達異常，進一步證明了lncRNA參與CHD的發生[30]。

lncRNA uc.4過表達可抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路，導致CHD的發生[31]。Anderson等[32]研究指出，抑制lncRNA Uph的表達可下調心臟特異性轉錄因子HAND2的表達，導致致死性右心室發育不全[32]。根據lncRNA與CHD的發生關系，lncRNA亦可作為潛在的生物標志物，用于CHD的產前檢測。

2.5 微小RNA

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉錄后基因表達調控。miRNA可與mRNA的3′UTR結合抑制RNA翻譯或導致RNA降解，從而抑制基因表達。一種miRNA可與多種不同靶基因相互作用從而影響整個基因表達調控網絡[33]。

miRNA在心臟發育過程中發揮重要的調控作用，參與調控心肌形態的發生、心肌細胞增殖和分化。因此，miRNA被視為CHD的重要治療靶點，如miRNA- 499被證實可作為檢測CHD的生物標志物[34]。研究表明，miRNA表達失調可導致右心室發育過程中重要轉錄因子TBX5、NOTCH1、HAND1和GATA3表達下降[35]。此外，Sucharov等[36]的研究也證明miRNA表達失調可導致嚴重的先天性心臟發育異常(如左心室發育不良)[36]。抑制miRNA- 184的表達可抑制心肌細胞增殖，并促使其凋亡，從而導致紫紺型CHD[37]。miRNA- 1通過促進HAND2(HAND2是心臟發育過程中的重要轉錄因子)的表達而促進心肌細胞增殖，并抑制caspase3剪切而降低心肌細胞的凋亡[38]。多項研究發現，法洛四聯癥患者的心肌組織中miRNA表達異常[39]。雖然miRNA與CHD的發生密切相關，但對于不同類型的CHD，特定的miRNA表達上調或下調及miRNA如何導致CHD的機制尚不清楚。

3 信號通路

心臟的發育和形成過程復雜，涉及心臟祖細胞的時空特異性譜系分化，以及心臟不同類型細胞的增殖、遷移和定位。因此，心臟的發育過程需協調不同信號通路以確保這些過程有條不紊進行。研究表明，在心臟的發育過程中，NOTCH、BMP和TGF-β等關鍵信號通路相互作用，共同促進心臟形態的建立[40]。

NOTCH信號通路在早期心臟發育過程中高度保守，參與細胞的發育、分化、增殖、凋亡、粘附和上皮-間質轉化過程。NOTCH受體可與心內膜細胞相互作用而調控心臟的形態，包括心臟腔室和瓣膜形成[41]。NOTCH信號通路參與調控上皮-間質轉化過程，調節心內膜-心肌相互作用，刺激肌小梁心肌細胞的產生。此外，NOTCH信號通路也參與調控心臟流出道的形成及肌小梁的致密化過程。因此，任何影響NOTCH信號通路的遺傳或非遺傳因素均可導致CHD的發生。動物實驗證明，小鼠NOTCH受體和配體的突變可導致包括先天性心臟缺陷在內的多種先天性畸形[42]。研究證實，左心發育不良綜合征患者亦存在NOTCH1突變[43]。

TGF-β信號通路在心臟發育過程中同樣發揮必不可少的調控作用，β2-spectrin為蛋白Smads的配體，其在TGF-β信號通路中發揮重要作用。動物實驗發現，小鼠β2-spectrin缺失可導致TGF-β信號通路失活，出現以左心室壁發育異常為主的心臟發育缺陷[44]。

4 營養素和代謝產物

近年來，關于母體孕前及孕早期營養素及代謝產物與CHD發生關系的研究成為熱點。胚胎期，母體代謝產物對胎兒的生長具有直接而重要的影響。孕期營養不良、吸煙、紫外線輻射等外部環境因素均可導致表觀遺傳學的改變，引起基因表達紊亂，增加CHD的發病率。

DNA甲基化很大程度上取決于從食物中獲取的甲基供體和輔因子的充足性，其是葉酸和蛋氨酸代謝的重要組成部分，因此孕期飲食可整體或在特定位點改變DNA的甲基化狀態，從而改變表觀遺傳調控圖譜。如母體長期營養不良，可能導致胎兒的印記基因胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)出現低甲基化，增加CHD患病風險。心臟發育過程中，葉酸及其衍生的同型半胱氨酸在心臟神經脊細胞遷移過程中發揮重要調控作用，圍孕期母體葉酸缺乏可能導致CHD的發生。動物實驗證實，圍孕期缺乏維生素A的胚胎大鼠心肌中GATA4出現異常甲基化，導致胚胎出現CHD表型[45]。研究表明，孕期母體重度肥胖可增加主動脈分支缺損、大動脈移位、ASD和動脈導管未閉等CHD的患病率[46]。因此，孕期攝入健康、均衡的生物活性成分，有助于建立正確的表觀遺傳調控圖譜，降低或預防CHD的發生。

5 研究模型

隨著CHD基礎研究的進步，成年CHD患者的存活率不斷提高。然而，這些現狀背后也引發了一些新的思考，如成年CHD幸存者的疾病復發風險是多少？是否存在預防CHD復發的相應措施？為研究這些問題，科學家們試圖構建動物模型以重現特定的CHD表型，采用具有特定遺傳學背景的動物或細胞模型開展CHD的致病機制研究，同時利用這些動物模型檢測新的治療策略。

在心臟發育和CHD研究領域，常用的動物模型包括果蠅、斑馬魚、青蛙、雞、小型哺乳動物(小鼠)、大型哺乳動物(綿羊、狗和豬)以及體外干細胞分化系統[47]。不同的研究模型有其自身的優勢和獨特性。小鼠模型易于反向遺傳操作，具有高度的序列保守性，具有與人類相同的心臟結構和心臟發育過程；其局限性在于制造轉基因小鼠需花費較長時間和較昂貴的成本，且CHD小鼠通常在圍產期死亡，從而限制了科學家對CHD小鼠的長期追蹤研究。斑馬魚模型雖然易于進行基因操作，生產周期較短，但其心臟結構(僅有2個腔室)與人類不同[48]。

近年來，科學家們利用CHD患者的iPSCs作為體外模型研究CHD的致病機制[49]。雖然體外iPSCs系統無法重現CHD患者的心臟形態結構，但其具有與患者自身最一致的遺傳學背景，可用來鑒定最相關的致病性分子調控機制。

6 小結

CHD的致病機制錯綜復雜，其發生是不同調控因素相互作用的結果，遺傳因素的改變可直接或間接通過表觀調控圖譜改變基因表達；同時，表觀遺傳調控的紊亂亦可改變基因表達，反向調控染色質的狀態，更深層次地影響基因表達。除遺傳和表觀遺傳致病因素外，圍孕期母體的營養素與代謝產物等環境因素也可改變表觀遺傳的調控狀態，進而改變基因表達模式，導致心臟發育異常。正常生理狀態下，遺傳與非遺傳因素相互影響、共同作用導致CHD的發生[50- 51](圖2)。

圖 2 遺傳因素、表觀遺傳因素、環境因素相互作用及與先天性心臟病的關系[50- 51]

目前CHD領域尚存在諸多待解決的問題，為進一步了解CHD的分子發生機制，需對其致病機制進行綜合分析。隨著高通量測序技術的廣泛應用，相信未來多學科交叉融合必將為人類揭示更精確、更豐富的CHD分子調控網絡，為CHD患者帶來新的曙光。

作者貢獻：艾珊珊負責構思并撰寫論文；何愛彬負責修訂及審校論文。

利益沖突：無