兩種石蠟包埋腎活檢組織轉制電鏡樣品的方法比較

沈麗君，李鐸，方周溪，陳朝生

1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腎內科，浙江 溫州 325015

電鏡檢查在腎臟病的診斷中起著十分重要，有20%～30%的腎臟病患者需要依賴電鏡得以確診[1-3]。 然而由于標本量不足或者取材不滿意等原因，在常規(guī)電鏡標本（組織經戊二醛和鋨酸雙重固定后，經脫水、樹脂包埋等步驟制作的標本）不可用的情況下，需要用4%中性甲醛固定、石蠟包埋的組織轉制電鏡標本用于診斷。石蠟包埋標本轉制電鏡樣品的方法有多種[4-6]，需要在日常工作中根據(jù)所在實驗室的實際情況（如標本類型、包埋劑種類、脫水劑種類等）選擇合適的實驗方案。目前各電鏡室常用的方法是將石蠟標本脫蠟后再水化，后經戊二醛和鋨酸雙固定后，再脫水包埋成塊。在結合多年的臨床實驗經驗和文獻報道[7]的基礎上，我們改進了一種以EPON 812為包埋介質的適合腎穿刺活檢標本石蠟塊轉制電鏡樣品的快速方法（以下簡稱快速脫蠟固定法），經與傳統(tǒng)水化后再轉制電鏡樣品的方法（以下簡稱水化法）對比研究，發(fā)現(xiàn)快速脫蠟固定法能夠得到比水化法更高質量的電鏡圖像，同時有效縮短樣品制備時間，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本：選取2018年5月至2019年9月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科確診的石蠟包埋塊標本共20例，其中IgA腎病6例、冷球蛋白血癥腎小球腎炎1例、狼瘡性腎炎5例、糖尿病腎病5例和腎淀粉樣變性病3例，所有患者均經腎臟穿刺病理診斷確診。本研究經溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.1.2 試劑配置：①含1%四氧化鋨的二甲苯溶液配置：1 g四氧化鋨（OSO4，TED PELLA，18456）溶于100 mL二甲苯溶液中；②包埋劑配置：選取PELCO?Eponate12試劑盒（TED PELLA，18010），參考Luft法的配方比例[8]，分別量取Resin 25.7 mL、DDSA 9.3 mL、MNA 16.5 mL，充分混勻后，加入0.8 mL DMP-30并再次混勻；③2%醋酸鈾水溶液配置：1 g醋酸鈾粉末溶于50 mL雙蒸水；④1%枸櫞酸鉛水溶液配置：0.1 g枸櫞酸鉛粉末（TED PELLA，96049）溶于5 mL雙蒸水，充分混勻后，滴加1 mol/L NaOH溶液至顆粒全部溶解且p H值約為12，加雙蒸水定容至10 m L，并用0.22 μm微孔濾器過濾，密封備用；⑤硅膠定向包埋板（北京中鏡科儀技術有限公司）；⑥被覆芳華膜的200目銅載網（北京中鏡科儀技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 石蠟標本取材方法：經4%中性甲醛固定、石蠟包埋的腎穿刺標本塊在體視顯微鏡下，對照HE染色結果，在蠟塊上腎小球相應位置用剃須刀片小心切下兩段1 mm長組織塊（見圖1）。一段用改進的快速脫蠟固定法處理，另一段采用經脫蠟-水化法處理后再轉制電鏡樣品[9]，并將兩種轉制方法所得的結果與同一樣品的常規(guī)電鏡的結果進行比較。

圖1 腎穿組織石蠟包埋標本組織取材示意圖

1.2.2 常規(guī)電鏡[10-11]步驟：1～2 mm長新鮮組織置于含2.5%戊二醛的0.1 mol/L等滲PB緩沖溶液中，4 ℃固定4 h以上。用0.1 mol/L PB緩沖液漂洗3次，并用1% OsO4水溶液4 ℃后固定1 h，隨后用蒸餾水漂洗3次，每次5 min，緊接著用50%、70%、80%、90%、100%（2次）丙酮對組織塊進行梯度脫水，每步 10 min。隨后將組織轉至丙酮:包埋劑（體積比為1:1）的溶液中37 ℃過渡1 h，接著用丙酮:包埋劑（體積比為1:4）的溶液37 ℃過夜?jié)B透。次日，用純包埋劑浸泡組織，放置45 ℃恒溫干燥箱1h，使包埋劑充分滲透入組織內部。并用硅膠定向包埋板進行定向包埋，包埋操作完成后置于45 ℃恒溫干燥箱3 h，后轉入65 ℃干燥箱過夜聚合。待樣品充分聚合后，對組織塊進行半薄切片，直至樣品中切到腎小球組織，隨后對該樣品進行修塊，對腎小球部位進行超薄切片，超薄切片厚度為70 nm，用被覆芳華膜的200目銅網撈片。超薄切片經2%醋酸鈾和1%枸櫞酸鉛雙染色后，用日立H7500透射電鏡進行觀察，并用GATAN公司的數(shù)字化CCD成像設備對數(shù)據(jù)進行拍照采集。

1.2.3 快速脫蠟固定法：將所取的石蠟組織塊置于50 μL 1%四氧化鋨二甲苯溶液中，65 ℃恒溫干燥箱放置10 min；隨后，用牙簽將組織塊挑至100 μL 純二甲苯中，37 ℃恒溫干燥箱放置15 min，并重復此純二甲苯脫蠟步驟3次，進一步充分脫蠟。將充分脫蠟后的組織用牙簽挑至二甲苯：包埋劑比例為1:1的過渡液中，37 ℃恒溫干燥箱放置1 h。隨后轉至純包埋劑中，45 ℃恒溫干燥箱放置1 h。并用硅膠定向包埋板進行定向包埋，包埋操作完成后置于45 ℃恒溫干燥箱3 h，后轉65 ℃干燥箱過夜聚合。自樣品取材至包埋完成，共耗時18 h。待樣品充分聚合后，同常規(guī)電鏡標本一樣，對樣品進行切片、染色、觀察和圖像數(shù)據(jù)采集。

1.2.4 水化法：將所取石蠟組織塊放入500 μL二甲苯中，60 ℃恒溫干燥箱放置30 min，并重復該操作1次。隨后將組織塊置于新的100 μL二甲苯溶液 中，37 ℃恒溫干燥箱放置15 min，并重復該操作4次。將脫蠟處理完成后的組織置于500 μL二甲苯:乙醇（比例為1:1）溶液中，37 ℃恒溫干燥箱中放置5 min。隨即分別用100%、95%、80%、70%、50%、30%乙醇依次進行梯度水化，每步水化時間各5 min。

水化完成后，將組織塊置于0.1 mol/L PB緩沖液中，室溫放置10 min，隨后換新的0.1 mol/L PB緩沖液，并重復這一操作3次，將乙醇充分漂洗干凈，并用含2.5%戊二醛的0.1 mol/L PB緩沖液固定組織4 h以上。戊二醛固定后的標本，后續(xù)操作流程同常規(guī)電鏡操作。

1.3 圖像處理與評價指標 本研究所用的電鏡數(shù)字成像設備為ORIUSTMCCD camera（美國Gatan公司），圖像處理軟件為ImageJ 1.52。每一例標本用不同制樣方法所得的圖像數(shù)據(jù)間進行橫向比較，主要從以下三方面進行對比：①肉眼判斷電子致密沉積物（electron-dense deposits，ED）結構清晰度以及沉積部位；②比較特征性超微結構保存的完整性，如狼瘡性腎炎患者腎小球毛細血管內皮細胞基質中的管網狀包涵體（tubuloreticular inclusions，Ti）和淀粉樣變腎病患者系膜基質上的纖維絲；③用ImageJ測量基底膜平均厚度，并統(tǒng)計分析不同石蠟轉制電鏡樣品方法基底膜厚度的改變情況。每例患者常規(guī)電鏡所得標本的基底膜平均厚度與同一患者石蠟轉制標本的平均基底膜厚度的差值，除以該患者常規(guī)電鏡基底膜平均厚度用以反映石蠟轉制電鏡樣品后平均基底膜厚度的改變情況。

基底膜平均厚度測量方法：每個樣品的腎小球部位隨機選取15～20個毛細血管，每個毛細血管隨機選5個位置（應均勻分布在毛細血管上，并避開ED的位置）測量基底膜厚度，并取其平均值作為被測毛細血管的平均基底膜厚度。將15～20個毛細血管測量的平均值作為該樣本的基底膜平均厚度。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以M（P25，P75）表示。由于2種石蠟轉制法組內均有個別數(shù)據(jù)缺失（僅見腎髓質組織），同時考慮數(shù)據(jù)略有偏態(tài)，因此對3組相關數(shù)據(jù)采用Friedman秩和檢驗進行分析。針對組間多項兩兩比較，SPSS軟件通過Bonferroni校正法調整顯著性值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種石蠟轉制方法保存腎小球特征超微結構的比較 幾種常見腎臟病類型的超微結構顯示，快速脫蠟固定法和水化法對組織超微結構的保存遠不如TEM組，表現(xiàn)在部分血管內皮細胞的胞質成分丟失以及足突形態(tài)改變，但在ED的保存方面，兩種石蠟轉制方法與常規(guī)電鏡法相差不大（見圖2A）。此外，為了更好地評價這兩種石蠟轉制電鏡樣品方法在臨床上的應用價值，我們比較了兩種轉制方法在特殊超微結構保存方面與常規(guī)電鏡法的差異，結果顯示這兩種方法在Ti的結構保存方面稍顯欠缺（見圖2B）；此外水化法處理的樣品淀粉樣纖維絲結構有不同程度的流失，快速脫蠟固定法對纖維絲的保存效果更接近常規(guī)電鏡法的效果（見圖2C）。由于腎小球毛細血管基底膜厚度及形態(tài)的改變是某些種類腎病的診斷依據(jù)，如薄基底膜腎病，但在實際應用中我們發(fā)現(xiàn)石蠟轉制電鏡的標本都出現(xiàn)了不同程度的基底膜厚度變薄的情況（見圖2D）。

2.2 兩種石蠟轉制方法對基底膜厚度的影響比較 測量每個樣品的平均基底膜厚度，用Friedman檢驗對3組數(shù)據(jù)進行比較，3組間差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.001）；快速脫蠟固定法和水化法與常規(guī)電鏡法比，基底膜厚度均顯著減少（P=0.043和P＜0.001）；快速脫蠟固定法與水化法比，基底膜厚度差異無統(tǒng)計學意義（P=0.210）。見表1。

3 討論

腎活檢病理診斷過程中，電鏡診斷是非常重要的一個環(huán)節(jié)，但是有時由于取材失誤、標本不滿意（未取到腎小球結構）等原因，需要用4%中性甲醛固定-石蠟包埋的標本轉制電鏡樣品[12-13]。本研究中，我們提出了一種經過改進的以EPON 812為包埋介質的快速轉制方法，并通過比較研究，以評價該方法在常規(guī)電鏡標本缺失的情況下在腎臟病臨床診斷應用中的價值。

由于電子致密沉積物在腎臟病理診斷中具有非常重要的作用，因此我們首先對比了兩種轉制法在保存ED結構方面的差異。與常規(guī)電鏡相比，兩種石蠟轉制方法均能使ED結構得以較好保存，說明兩種轉制方法在臨床診斷中均有使用價值。考慮到某些種類腎臟病的超微病理診斷除了辨別ED的沉積部位和形態(tài)外，還需要借由一些特征性的超微結構加以確診，例如，部分狼瘡性腎炎患者的腎小球毛細血管內皮細胞基質上的管網狀包涵體[12]，淀粉樣變腎病患者節(jié)段性系膜基質上直徑8～10 nm的纖維絲等[13]，因此，我們對狼瘡性腎炎患者和淀粉樣變腎病患者的上述特征性結構進行了對比。兩種轉制方法雖然能夠保留上述兩種特征性結構，但其結構完

整性破壞較大，尤其是水化法轉制的標本，淀粉樣纖維絲結構有所損失，其原因可能由于水化法處理步驟比較多，脫蠟、水化及脫水3個步驟均涉及到有機溶劑處理，對樣品的成分抽提較快速脫蠟固定法更嚴重。不僅如此，從樣品制備時間比較，水化法耗時更久（33 h），而本研究中的快速脫蠟固定法，由于直接在二甲苯中邊脫蠟邊固定，不需要水化及脫水步驟，大大節(jié)約了樣品制備時間（18 h），在滿足樣品診斷需求的前提下，提高工作效率，縮短患者等待報告的時間。此外，通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)兩種轉制方法均存在基底膜變薄的假象，提示這兩種轉制方法均不適用于需要通過測基底膜厚度進行診斷的腎病類型（如薄基底膜腎病、早期的糖尿病腎病等）[14-15]。

圖2 兩種石蠟標本轉制電鏡樣品方法與常規(guī)電鏡結果比較

表1 不同制樣方法樣品的基底膜厚度比較[每組n=11，M（P 25，P 75），nm]

綜上所述，本研究比較了兩種石蠟轉制電鏡樣品的方法，其中快速脫蠟固定法無需經過逐級的水化、漂洗、后固定及脫水等繁瑣的步驟，可有效縮短制樣時間，且鋨酸后固定與脫蠟同步進行，使得組織結構得到較好保存，減少人為操作對組織成分的洗脫、抽提作用。因此，在常規(guī)腎活檢組織電鏡標本無法滿足檢測的情況下，快速脫蠟固定法不失為一種更好的替代方法。