激活自噬對關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素大鼠骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的影響

薛恩興，胡飛，李浩量，邱思桐，周騰，吳登穎

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 關(guān)節(jié)與骨病外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的以進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退行性變、功能障礙為主的疾病[1]。糖皮質(zhì)激素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射是臨床廣泛使用的治療OA的方法[2]。雖然長期反復(fù)使用糖皮質(zhì)激素會帶來諸多不良反應(yīng)，但針對某些特定病程階段的人群（如局部應(yīng)用非甾體類抗炎藥無效但尚不需要手術(shù)干預(yù)的人群），糖皮質(zhì)激素的使用是可以進(jìn)行權(quán)衡的。因此改進(jìn)糖皮質(zhì)激素在OA治療中的應(yīng)用方 式、研究其作用機(jī)制，成為熱點和難點。自噬對細(xì)胞生長、分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡起重要作用[3]。研究表明，自噬與關(guān)節(jié)軟骨的退變密切相關(guān)，腹腔或者關(guān)節(jié)腔注射雷帕霉素會提高自噬水平，可以明顯緩解大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變的程度[4-5]。本研究圍繞糖皮質(zhì)激素關(guān)節(jié)內(nèi)注射和改變機(jī)體自噬水平，觀察激活自噬對關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素大鼠OA進(jìn)展的影響，以初步探索減少臨床上使用糖皮質(zhì)激素相應(yīng)不良反應(yīng)的方法和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量約270 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于適宜的環(huán)境中（溫度為20～28 ℃，濕度為45%～70%，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水）。本實驗中動物的倫理事項遵循NIH實驗動物指南，實驗動物許可證號：SCXK（浙）-2015-0009。

1.1.2 試劑和儀器：地塞米松、safranin-O（美國Sigma公司）；雷帕霉素（上海源葉生物科技有限公司）；兔抗來源的P62抗體原液（美國Abcam公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Olympus BX-40光學(xué)多倍倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Leica-CM1900組織切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、造模（OA）組、糖皮質(zhì)激素（OA+GS）組、雷帕霉素（OA+RAPA）組、糖皮質(zhì)激素+雷帕霉素（OA+GS+ RAPA）組，每組10只。

采用以Hulth造模法為基礎(chǔ)的大鼠OA造模方法[6]。Sham組沿手術(shù)入路劃皮后直接將切口進(jìn)行縫合。其余各組大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后仰臥位固定。在無菌條件下，取內(nèi)側(cè)縱行切口，暴露膝關(guān)節(jié)，離斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，手術(shù)中盡量避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面，8周后觀察大鼠關(guān)節(jié)炎造模成功情況。OA+GS組和OA+GS+RAPA組大鼠第6周開始在膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素，每周1次，連續(xù)4次。糖皮質(zhì)激素劑量= 6.25（人與大鼠用藥等效劑量換算出的固定系數(shù)）× 0.42 mg/kg，每只大鼠每次注射0.709 mg（0.028 mL） 即為相應(yīng)人體的常規(guī)劑量。OA+RAPA組和OA+GS+ RAPA組從手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射自噬激活劑雷帕霉素，每天1 mg/kg，持續(xù)10周。Sham組與OA組予以同劑量的DMSO腹腔注射。術(shù)后第10周，處死所有實驗大鼠，取其右膝關(guān)節(jié)組織，固定、脫鈣后制作成組織蠟塊，進(jìn)行下一步的實驗分析。

1.2.2 組織學(xué)safranin-O固綠（S-O）染色：大鼠組織切片脫蠟、水化，置入蘇木精染色液中7 min，蒸餾水漂洗2次后，浸泡入分色液中3～5 s，再次漂洗5次，然后將組織切片置入0.05%的Fastgreen染色液中1～5 min，蒸餾水漂洗3次，置于1%醋酸溶液中分色處理，結(jié)束后再次進(jìn)行漂洗。切片脫水、透明、封片，鏡下觀察。

1.2.3 組織評分：對S-O染色后的組織切片進(jìn)行評分。通過OARSI評分系統(tǒng)[7]評估大鼠關(guān)節(jié)軟骨的退變程度。0分：表面完整，軟骨完好無損；1分：表面完整；2分：表面不連續(xù)；3分：垂直裂縫；4分：侵蝕；5分：剝蝕；6分：變形。將內(nèi)側(cè)股骨和脛骨平臺分?jǐn)?shù)相加（0～12分）以評估關(guān)節(jié)軟骨退變的程度。采用滑膜評分來評估大鼠關(guān)節(jié)滑膜的改變[7]。0分：光滑正常，半透明的滑膜組織，血管稀疏清晰；1分：局灶性受累，輕微變色，可見增生/纖維化/增厚，血管明顯增加；2分：彌散性受累，輕微變色，可見增生/纖維化/增厚，血管顯著擴(kuò)張；3分：中度彌漫性浸潤，嚴(yán)重變色，明顯增生/纖維化/增厚，中度血管增生；4分：顯著漫性浸潤，嚴(yán)重變色，顯著的增生/纖維化/增厚，彌漫性血管過度增生；5分：嚴(yán)重彌漫性浸潤，嚴(yán)重變色，嚴(yán)重的增生/纖維化/增厚，組織纖維化和嚴(yán)重的血管過度增生。

1.2.4 免疫組化染色：大鼠組織切片脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉后，加一抗于4 ℃冰箱中保存過夜。PBS漂洗，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后將組織置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min。顯色、復(fù)染蘇木精后，切片脫水、封片，拍攝圖像后使用Image J 2.1軟件對陽性點進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠軟骨改變 由圖1可見，OA組的關(guān)節(jié)軟骨部分區(qū)域出現(xiàn)缺損，OA+GS組缺損依舊比較嚴(yán)重，OA+RAPA組的軟骨表面侵蝕有所好轉(zhuǎn)，而OA+ GS+RAPA組大鼠糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用雷帕霉素后，?關(guān)節(jié)軟骨侵蝕的現(xiàn)象則進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織評分比較 OA組大鼠OARSI評分較Sham組顯著升高（P＜0.05），證明造模成功；OA+GS組大鼠OARSI評分與OA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；OA+RAPA組大鼠評分與OA組比較有所降低（P＜0.05），OA+GS+RAPA組大鼠評分與OA+GS組比明顯較低（P＜0.05）。見圖2。

OA組滑膜出現(xiàn)肥大增生癥狀，OA+GS組滑膜評分與OA組比較明顯降低（P＜0.05），而OA+GS+RAPA組的滑膜評分與OA+GS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見圖3。

2.3 各組大鼠免疫組化染色結(jié)果 如圖4所示，OA組關(guān)節(jié)表面存在大量P62陽性表達(dá)，OA+GS組、OA+RAPA組陽性點較OA組減少；定量分析比較得出，OA+GS+RAPA組陽性比例較OA+GS組、OA+RAPA組進(jìn)一步減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

OA是目前老年人疼痛和殘疾的主要原因之一，肥胖、衰老、關(guān)節(jié)損傷和生物力學(xué)異常被認(rèn)為是OA的主要危險因素[8]。臨床上對于OA階梯治療的非手術(shù)階段通常是以控制疼痛、抗炎、消除關(guān)節(jié)腫脹等姑息方法來延緩其進(jìn)展。

非甾體類抗炎藥是有效的止痛藥，但不能治療或預(yù)防潛在的疾病，且會對使用者胃腸道與心血管造成危害，臨床上通常以短期或中短期，根據(jù)需要間歇使用[9]。目前，對于口服或局部鎮(zhèn)痛藥尚不能緩解癥狀的患者，指南建議聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇激素治療[10]。糖皮質(zhì)激素可減輕免疫反應(yīng)，降低毛細(xì)血管通透性，減輕充血，促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)水腫消退，從而起到抗炎、鎮(zhèn)痛、消腫的作用[11-12]， 但是長期使用會帶來骨質(zhì)疏松、代謝紊亂、皮膚萎縮等不良反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素對各種類型的細(xì)胞存在毒性作用，使用糖皮質(zhì)激素會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞減少和凋亡[13-14]。本研究在動物模型上模擬關(guān)節(jié)內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素，相比OA組，注射糖皮質(zhì)激素后大鼠的滑膜評分有所降低，關(guān)節(jié)內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素可以在一定程度上抑制OA進(jìn)展中關(guān)節(jié)滑膜的炎性增生，但是，OARSI評分結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素干預(yù)下，軟骨侵蝕現(xiàn)象并未有明顯的改善。

自噬是一種程序性死亡方式，已有研究證實降低軟骨細(xì)胞P62水平，增強(qiáng)LC-3 II/LC-3 I的表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞基質(zhì)降解[15]。而體內(nèi)實驗通過敲除自噬特異性基因Atg5和Atg7抑制自噬水平后，軟骨細(xì)胞的死亡增加，增殖減少，進(jìn)一步證實自噬對軟骨細(xì)胞生存和維持正常生理功能起重要的作用[16]。 研究報道，自噬可以抑制IL-1β引起的軟骨細(xì)胞中aggrecan、II型膠原等基因的下降，并可以維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡[4]。OA的病理表現(xiàn)不僅包括物理上的磨損過程，還涉及到軟骨侵蝕、破壞增多，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)紊亂，滑膜組織增生等一系列復(fù)雜的過程，其中，軟骨表面破壞是最明顯的改變。P62是眾所周知的自噬相關(guān)蛋白，也稱為SQSTM1蛋白，可在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)自噬的作用。本研究顯示，OA組關(guān)節(jié)軟骨破壞增多，滑膜增生，軟骨中P62表達(dá)增多，而通過上調(diào)大鼠的自噬水平，能對關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)功能。OA+GS+RAPA組中，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕與破壞得到了明顯的緩解，免疫組化結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨中P62的表達(dá)下降，這說明上調(diào)自噬對關(guān)節(jié)軟骨的退變有一定的積極干預(yù)作用。

圖4 大鼠關(guān)節(jié)軟骨P62免疫組化結(jié)果及陽性細(xì)胞比例（×10）

綜上所述，激活自噬對糖皮質(zhì)激素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的OA大鼠的關(guān)節(jié)軟骨具有顯著保護(hù)作用，而干預(yù)自噬可能是減輕糖皮質(zhì)激素治療OA產(chǎn)生不良反應(yīng)的新方向。