MicroRNA-34a通過下調Notch1的表達促進心肌細胞凋亡

潘嘉林，林叢，周莉莉，黃明遠，陳曄

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 心血管內科，浙江 溫州 325027

MicroRNA（miRNA）是一類長約21～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。miRNA在幾乎所有的病理過程中發揮著至關重要的作用。miR-34a已被證明可以調節多種靶向蛋白，調控細胞周期和凋亡等。與其他器官相比，miR-34a在心肌梗死后的心臟組織中高表達，這結果為研究慢性心力衰竭治療的新策略提供依據[1]。已有研究發現，沉默整個miR-34家族可以保護心肌梗死后心臟的病理性結構重 構[2]。但在心肌缺血的情況下，miR-34對心肌細胞的作用和具體機制目前尚未明了。本課題組前期研究表明，miR-34a在大鼠心肌梗死后的心肌細胞中表達增加，可能具有促進心肌細胞凋亡的作用[3]。本研究設計體外培養大鼠心肌細胞，進一步探討miR-34a是否通過Notch1通路調節心肌細胞凋亡及其具體機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 大鼠心肌細胞株H9C2培養在含10% FBS的DMEM培養基中，培養條件：恒溫37 ℃、1% O2、94% N2、5% CO2，平均3 d進行一次傳代培養。

1.2 轉染和分組 經傳代培養后的H9C2細胞接種到6孔板中，再轉染5 μL的FAM-miRNA或siRNA，以Lipofectamine 2000（5 μL）為轉染介質。實驗分6組：①miR-34a組：轉染miR-34a mimics；②miR-NC組：陰性對照細胞，轉染隨機合成NC microRNA片段；③miR-inhibitor組：轉染miR-34a inhibitor；④siRNA+miR-inhibitor組：先轉染siRNA-Notch1，再轉染miR-inhibitor；⑤siRNA-NC+miR-inhibitor組：先轉染隨機合成NC siRNA片段，再轉染miRinhibitor；⑥normal組：正常培養的細胞，作空白對照。轉染后培養箱中繼續培養24～48 h。

1.3 miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和siRNA-Notch1片段的合成 由上海吉瑪公司設計并合成。miR-34a mimics序列：正義鏈：5’-UGGCAGUGU CUUAGCUGGUUGU-3’，反義鏈：5’-AACCAGCUAAGACACUG CCAUA-3’；miR-34a inhibitor序列：5’-ACCGUCACAGA AUCGACCAACA-3’；siRNA-Notch1序列：5’-TTGGGACAGG UAUACCAAACA-3’。隨機合成的NC microRNA與NC siRNA大鼠基因組各基因均無顯著同源性。

1.4 RT-qPCR測定miR-34a的表達 各組體外培養的H9C2細胞轉染24 h后，加TRIzol裂解細胞，氯仿萃取，用異丙醇濃縮過夜，提取總RNA，再用酶標儀和甲醛變性凝膠電泳質檢總RNA的純度和質量，再取100 ng總RNA，應用miRNA Isolation Kit分離小分子RNA，應用miScript Reverse Transcription Kit反轉錄合成c DNA，以ABI 7500 FAST型熒光實時定量PCR儀進行定量PCR測定，檢測各組中miR-34a的含量。PCR條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。采用U6 RNA作為內參，計算方法采用ΔΔCT（CT表示PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數）公式，miR-34a的ΔCTsample=CT sample-CT/U6 sample，ΔCT control=CT control-CT U6 control，ΔΔCT=ΔCT sample-ΔCT control）。

1.5 Western blot檢測caspase-3和Notch1的表達 各組體外培養的H9C2細胞轉染24 h后，加蛋白裂解液（RIPA:PMSF=99:1）裂解細胞提取蛋白質，BCA法測定蛋白濃度，各組取30 μg蛋白行10% SDSPAGE電泳，轉膜，再用含5%脫脂牛奶封閉1.5 h。 一抗[casp ase-3 antibod y（美國Abcam公司）1:1 000，Notch1 antibody（美國Abcam公司）1:500] 4 ℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入IgG抗體（美國Abcam公司，1:4 000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統選擇800通道進行掃描條帶，以β-actin作為內參照標化caspase-3和Notch1蛋白質表達，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進行半定量分析。

1.6 流式細胞技術檢測凋亡 細胞凋亡檢測采用Annexin V-allophycocyanin（APC）染色（德國eBioscience公司）并使用FACScan流式細胞術檢測（美國BD公司）。H9C2細胞以約2.0×104/mL的密度接種在六孔板中，轉染24 h后，收集細胞，用冰冷的PBS洗滌兩次，然后重懸細胞，標準化細胞濃度至1×106/mL。再用Annexin V-APC在室溫黑暗中染色15 min，最后上機流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 雙熒光素酶報告基因技術測定靶基因 通過miRNA靶基因預測網站（http://www.targetscan.org）預測到Notch1是miR-34a靶基因之一。分別克隆Notch1基因的野生型（WT）以及突變型（MUT）的3’UTR序列，并通過限制性內切酶分別將兩個序列整合到PGL3-REPORT熒光報告載體中，構建成PGL3-Notch1-WT和PGL3-Notch1-MUT兩個載體。實驗分2 組：①WT組：將PGL3-Notch1-WT載體和miR-34a mimics同時轉染細胞，以PGL3-Notch1-WT載體和miR-NC共轉染的熒光素酶活性進行標準化；②MUT組：將PGL3-Notch1-WT載體和miR-34a mimics同時轉染細胞，以PGL3-Notch1-MUT載體和miR-NC共轉染的熒光素酶活性進行標準化。熒光素酶活性由熒光素酶報告試劑盒（美國Promega公司）測定。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS20.0統計軟件進行處理。計量資料用 ±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組miR-34a表達量比較 與miR-NC組比較，miR-34a組心肌細胞miR-34a表達量明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與miR-NC組比較，miRinhibitor組、siRNA+miR-inhibitor組和siRNANC+miR-inhibitor組miR-34a表達量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。表明H9C2細胞成功轉染了miR-34a mimics和miRNA inhibitor，見圖1。

圖1 各組miR-34a表達量

2.2 各組caspase-3和Notch1蛋白表達量比較 與miR-NC組比較，miR-34a組心肌細胞caspase-3的表達量明顯增多，Notch1的表達量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01），miR-inhibitor組、siRNANC+miR-inhibitor組casp ase-3的表達量明顯減少，Notch1的表達量顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與siRNA-NC+miR-inhibitor組比較，siRNA+miR-inhibitor組caspase-3的表達量明顯增多，Notch1的表達量顯著減少，差異有統計學意義 （P＜0.01），見圖2。

2.3 各組細胞凋亡率比較 各組凋亡率分別為：miR-34a組23.83%±3.54%，miR-NC組4.33%±0.56%，miR-inhibitor組2.84%±0.47%，siRNA+miR- inhibitor組18.96%±3.76%，siRNA-NC+miR- inhibitor組3.05%±0.49%，normal組4.67%± 0.63%。與miR-NC組比較，miR-34a組細胞凋亡率明顯增高，miR-inhibitor組細胞凋亡率明顯減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與siRNA-NC+miRinhibitor組比較，siRNA+miR-inhibitor組細胞凋亡率明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

圖2 各組caspase-3和Notch1蛋白表達量

2.4 雙熒光素酶報告基因技術測定靶基因 通過targetscan靶基因預測網站預測Notch1是miR-34a靶基因之一，見圖4A。雙熒光素酶報告結果顯示，與MUT組比，WT組miR-34a熒光活性明顯減弱，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4B。

3 討論

隨著老齡化的進展，冠心病的發病率逐年增多，在其發生發展過程中，持續缺血極易導致心肌細胞凋亡和壞死。近年來，一些miRNAs已經被證明可以參與并調節急性心肌梗死病理生理發展的重要過程[4]。MiR-34家族在脊椎動物中高表達，在細胞凋亡的進程中發揮著重要作用，尤其是腫瘤的發生發展過程[5]。MiR-34的表達下調可促進乳腺癌細胞的增殖和凋亡，而miR-34a的過表達可抑制乳腺癌的發生[6]。在心臟的研究中發現，急性心肌梗死后循環中miR-34a水平顯著上調，而miR-34a水平與死亡和心力衰竭的風險增加相關，提示miR-34a可能是預測左心室重構的有用的生物標志物[7]。之前的研究發現，通過阻斷左前降支建立大鼠急性心肌梗死模型，miR-34a在梗死后的心肌組織中表達顯著增多[3]，而增多miR-34a可能參與心肌梗死后的心肌細胞凋亡。在其他研究中也觀察到了類似的結果，在急性心肌梗死患者和大鼠的血清中均觀察到miR-34a表達上調，并進一步證實miR-34a能促進細胞凋亡[8]。在阿霉素誘導的心臟毒性的研究中也有miR-34a表達上調的報道，沉默miR-34a的表達可以緩解阿霉素的心臟毒性，對心臟具有保護作用[9]。在另一項研究中也表明，高齡小鼠心臟組織中miR-34a表達增加，導致心肌凋亡水平明顯升高[10]。這些研究均提示，心肌細胞過表達miR-34a與心肌細胞凋亡相關，但具體機制目前尚未明了。

圖3 流式細胞技術檢測各組細胞凋亡率

圖4 雙熒光素酶報告基因技術測定靶基因

將miR-34a mimics轉染H9C2細胞上調miR-34a的表達后發現，caspase-3表達增多，細胞凋亡率顯著增加，而通過抑制轉染miR-34a inhibitor下調miR-34a的表達則得到相反的結果，表明miR-34a具有促進心肌細胞凋亡的作用。在高糖誘導細胞凋亡的研究中也發現了類似的結果，在高糖處理的心肌細胞中發現miR-34a過表達，miR-34a mimics抑制抗凋亡相關基因bcl-2表達，增加心肌細胞凋亡，并確定了bcl-2是miR-34a的靶基因[11]。在另一項關于干細胞治療缺血性心臟病的研究中也發現，miR-34a抑制HSP70的表達，而后者被證明可以保護Sca-1干細胞，具有抗凋亡的作用，miR-34a的表達下調可以提高Sca-1干細胞的存活率[12]。因此，本研究結果提示miR-34a在心肌細胞凋亡過程中發揮了關鍵作用。

有研究顯示，miR-34a表達下調對心臟潛在保護作用是通過Wnt/catenin信號通路從而抑制梗死后心肌細胞凋亡[13]。本研究發現，心肌細胞通過轉染miR-34a mimics過表達miR-34a，則Notch1的表達顯著減少，細胞凋亡率明顯增加，而通過轉染miR-34a inhibitor下調miR-34a的表達則會導致相反的結果。可見Notch1的表達和與miR-34a表達呈負相關。通過Targetscan靶基因預測網站信息了解到Notch1基因的3’UTR區有部分堿基與miR-34a完全互補配對，提示Notch1可能是miR-34a潛在靶基因之一，并用雙熒光素酶實驗進一步證實。在卵巢癌細胞的研究也有報道，Notch1是miR-34的靶基因，miR-34家族促進癌細胞凋亡和抑制癌細胞的侵襲作用機制可能與下調Notch1的表達有關[14]。在乳腺癌細胞研究中也發現，miR-34a通過下調靶基因Notch1的表達，促進細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲[15]。在心臟和肺微血管內皮細胞凋亡的研究中也發現，Notch1的表達受miR-34a的調節[16]。 在先天性心臟病的研究也證實，miR-34a通過調節Notch信號通路促進心肌細胞凋亡[17]。Notch1信號通路已被證明是凋亡相關通路之一，參與多種細胞的凋亡[18]。缺氧/復氧誘導心肌細胞凋亡的研究發現，Notch1信號通路受抑制，而細胞內過表達Notch1具有心臟保護作用[19]。本研究通過轉染miR-34a inhibitor下調miR-34a的表達，則Notch1表達升高，細胞凋亡減少，而用siRNA下調Notch1的表達，可阻斷miR-34a低表達引起的抗凋亡作用。類似的結論在另一項研究中也被證實，抑制miR-34a-5p可調節Notch1信號通路，從而保護心肌缺血再灌注損傷誘導的細胞凋亡[20]。本研究表明，miR-34a調節心肌細胞凋亡是通過靶定Notch1的作用實現的。這一結果進一步闡明了miR-34a在參與缺血誘導的心肌凋亡方面的機制。

綜上所述，過表達miR-34a可抑制Notch1的表達，促進心肌細胞凋亡，下調miR-34a的表達可引起Notch1的表達增多，發揮抗凋亡的作用，熒光素酶實驗證實Notch1是miR-34a的靶基因。以上結果提示，miR-34a通過調節靶基因Notch1參與心肌細胞凋亡的調節。